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Tesi etd-01092009-104444


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
CARZOLI, FILIPPO GIACOMO
URN
etd-01092009-104444
Title
Controllo dell'altezza in girasole: isolamento e caratterizzazione di geni del metabolismo delle gibberelline
Struttura
AGRARIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE VEGETALI E MICROBICHE
Commissione
Relatore Dott. Pugliesi, Claudio
Parole chiave
  • geni del metabolismo delle gibberelline
  • Heliantus annuus
  • KNOX
  • controllo dell'altezza
Data inizio appello
26/01/2009;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
26/01/2049
Riassunto analitico
Le gibberelline (GA) costituiscono una famiglia di ormoni vegetali coinvolta in molti aspetti di crescita e sviluppo delle piante come l’allungamento dei fusti, la germinazione, la transizione dalla crescita vegetative alla fioritura, lo sviluppo dei semi e dei frutti. Anche se sono state identificate più di 126 diverse GA in piante e funghi, solo poche di queste sono biologicamente attive. Le più importanti, quelle che hanno i maggiori effetti nello sviluppo delle piante, sono la GA1 e la GA4 che differiscono per la presenza o assenza, rispettivamente, di un gruppo ossidrilico al C-13. Le GA derivano tutte dal medesimo precursore geranil-geranil pirofosfato, la via biosintetica è comune a tutte le GA fino alla formazione dell’ent-kaurene. La formazione delle GA bioattive a partire dall’ent-kaurene richiede una serie di riduzioni ossidative catalizzate da mono-ossigenasi di membrana e diossigenasi solubili e ha luogo nei plastidi e nel citoplasma.<br>Analisi genetiche e molecolari di mutanti di numerose dicotiledoni e monocotiledoni caratterizzati da un fenotipo nano o iperallungato hanno dimostrato che le gibberelline sono regolatori fondamentali nel modulare la crescita del fusto e nel determinare pertanto la dimensione finale delle piante. Il controllo della taglia delle piante è stato sempre uno degli obbiettivi e delle maggiori innovazioni in agricoltura. Nei cereali la selezione di varietà a taglia bassa di frumento tenero (Triticum aestivum L.), grano duro (Triticum turgidum L. var. durum) e riso (Oryza sativa L.), in concomitanza con l’adozione di nuove pratiche agricole che prevedevano un largo uso di fertilizzanti azotati ed erbicidi, ha dato origine, negli anni 60-70, al grande aumento di produzione mondiale di cereali durante la cosiddetta “Green Revolution”. I geni responsabili di questi fenotipi nani sono stati individuati ed è stato constatato che la loro azione interferiva con la biosintesi e la via di trasduzione del segnale delle GA.<br>L’importanza di ottenere una diminuzione delle dimensioni delle piante ha anche portato l’industria chimica allo sviluppo di varie classi di ritardanti della crescita che agiscono inibendo, in vari punti, la biosintesi e la percezione delle GA. Il potenziale rischio alla salute e all’ambiente derivante dalla loro applicazione però, ha posto oggi molti limiti al loro impiego che non appare sostenibile nel lungo termine. Per questi motivi un controllo genetico sulla statura delle piante è assai preferibile all’uso di ritardanti della crescita. D’altro canto geni per il carattere di taglia bassa non sono disponibili per tutte le specie di interesse agronomico. Pertanto l’introduzione, tramite tecniche di ingegneria genetica, di geni per la modificazione dei livelli di GA attive o della percezione di questi fitormoni rappresenta una valida alternativa all’uso di regolatori di sintesi.<br><br>Le diossigenasi coinvolte nelle ultime fasi della sintesi di GA, le GA 20-ossidasi (GA20ox) e le GA 3-ossidasi (GA3ox), e gli enzimi che disattivano le GA, le GA 2-ossidasi (GA2ox), rappresentano i più importanti siti di regolazione nel metabolismo di questa classe di ormoni. Pertanto i geni per questi enzimi sono i principali candidati per un eventuale intervento biotecnologico.<br>Lo sviluppo di genotipi a taglia bassa è un obbiettivo importante nella selezione di nuove varietà di girasole (Helianthus annuus L.). Uno dei maggiori svantaggi che si presenta nella coltivazione di questa specie, soprattutto in colture in cui sono adottate frequenti irrigazioni, è il forte aumento in altezza non supportato da un adeguato sviluppo radicale. Pertanto in aree coltivate caratterizzate da forti venti le piante sono spesso soggette ad allettamento dovuto ad una bassa capacità di ancoraggio delle piante stesse. La riduzione della taglia pertanto potrebbe portare ad un incremento dell’harvest index e ad una minore predisposizione all’allettamento anche in condizioni di alte fertilizzazioni azotate. Da qualche anno inoltre il girasole è utilizzato anche come specie ornamentale da vaso fiorito. Ciò ha determinato la ricerca di cultivar che oltre a caratteristiche ornamentali adeguate possedessero anche un ridotto sviluppo in altezza e in dimensioni generali, requisito fondamentale in questo ambito di produzione. Anche se alcune cultivar con queste caratteristiche sono state prodotte, l’uso di inibitori della crescita è lo stesso fondamentale per riuscire a mantenere nella produzione gli standard qualitativi imposti dal mercato. Pertanto la costituzione di varietà a taglia bassa potrebbe ovviare nel campo della floricoltura all’uso di brachizzanti con un abbattimento dei costi di produzione e un minore impatto ambientale.<br>In questo lavoro sono stati isolati dal girasole due geni, HaGA20ox1 e HaGA20ox2, che mostrano le caratteristiche tipiche ed una forte omologia con le GA 20-ossidasi di diverse altre specie di piante ed un terzo gene, HaGA2ox1, che codifica per una GA 2-ossidasi di classe I. Questi geni, nelle specie in cui sono stati studiati, intervengono nei più importanti steps di regolazione dei livelli di GA e pertanto possono essere presi in considerazione per un loro possibile impiego nella manipolazione, mediante tecniche di ingegneria genetica, del metabolismo delle GA al fine di costituire nuove varietà di girasole a taglia bassa.<br>I geni Ga20ox di girasole hanno una struttura simile costituita da tre regioni esoniche e due regioni introniche; struttura riscontrata anche nei geni codificanti GA 20-ossidasi di altre specie sia dicotiledoni che monocotiledoni. Le sequenze aminoacidiche dedotte dai cDNA dei due geni mostrano un alto livello di similarità con un identità tra HaGA20ox1 e HaGA20ox2 dell’84%.<br>Le analisi filogenetiche condotte mostrano come le sequenze aminoacidiche delle GA20ox delle dicotiledoni e delle monocotiledoni siano separate in due gruppi distinti e che all’interno delle dicotiledoni HaGA20ox1 e HaGA20ox2 formino un sottogruppo con le GA 20-ossidasi di Lactuca sativa (Ls20ox1 e Ls20ox2), Chrysanthemum x morifolium (DgGA20ox1) e Daucus carota (DcGA20ox2). Tra queste entrambe le sequenze di HaGA20ox1 e HaGA20ox2 mostrano un più elevato grado di similarità con Ls20ox1di L. sativa.<br>Il grande accumulo di trascritti di entrambi i geni GA20ox evidenziato negli embrioni coincide con il loro periodo di massimo accrescimento, suggerendo che le GA rivestano un ruolo importante nella prima fase di maturazione dell’embrione di girasole. HaGA20ox1 è espresso in tutti gli organi presi in considerazione sebbene un maggior accumulo di mRNA si manifesti nei germogli vegetativi e nelle radici; i trascritti di HaGA20ox2 sono invece accumulati preferenzialmente nel meristema dell’infiorescenza, nel germoglio vegetativo, nelle radici e negli internodi del fusto. Trattamenti di piante con un inibitore della biosintesi delle GA hanno dimostrato che, mentre il gene HaGA20ox2 è soggetto ad una consistente attivazione a feedback in risposta a bassi livelli di GA, HaGA20ox1 non sembra partecipare a tale processo regolativo.<br>Analogamente ad altri geni di mono e dicotiledoni codificanti per GA2ox di classe 1, HaGA2ox1 è costituito da tre esoni e due introni. Le maggiori differenze fra le varie specie risiedono nella lunghezza degli introni. La sequenza aminoacidica dedotta dal cDNA di questo gene mostra il più alto grado di similarità con la sequenza GA 2-ossidasi1 (LsGA2ox1) di L. sativa (identità dell’89%).<br>Le analisi filogenetiche condotte hanno evidenziato una suddivisione in tre classi ben distinte delle sequenze rintracciate di GA 2-ossidasi di mono e dicotiledoni. La sequenza aminoacidica di HaGA2ox1 è inclusa nel gruppo di GA2ox di classe I indicando che l’enzima codificato da questo gene è in grado di promuovere la catalisi sia di GA C19, tra le quali le due GA attive più importanti GA1 e GA4, sia delle GA C20. All’interno del gruppo delle GA2ox di classe I, HaGA2ox1 forma un sottogruppo con le sequenze aminoacidiche dei geni LsGA2ox1 di L. sativa e CmGA2ox1 di Chrysanthemum x morifolium.<br>Dalle analisi effettuate per mezzo della tecnica della RT-PCR semiquantitativa HaGA2ox1 risulta essere espresso in maniera ubiquitaria nei vari organi testati di girasole ma un maggior livello di trascritti si registra nel meristema dell’infiorescenza e nelle radici. Trattamenti su semi di girasole con acido gibberellico hanno messo in evidenza solo una debole regolazione positiva a feedforward della trascrizione di questo gene in risposta all’aumento dei livelli di GA.<br>Le GA sono implicate nel mantenimento delle funzioni del meristema tramite l’interazione di alcuni geni del loro metabolismo con i geni homeobox KNOTTED1-like (KNOX). I geni KNOX infatti reprimono direttamente, nel meristema, l’espressione dei geni per le GA 20-ossidasi (GA20ox), gli enzimi che agiscono nel penultimo step della sintesi delle GA. Inoltre SHOOTMERISTEMLESS (STM), una proteina KNOX di Arabidopsis, regola positivamente la trascrizione dei geni per la disattivazione delle GA, AtGA2ox4 e AtGA2ox6. Nel complesso si ritiene che questo tipo di regolazione possa contribuire al mantenimento di bassi livelli di GA da parte delle proteine KNOX nel meristema. Poiché i KNOX sono anche in grado di attivare la biosintesi delle citochinine (CK), si è ipotizzato che questi regolatori promuovano e mantengano le funzioni del SAM orchestrando l’espressione dei geni per la biosintesi delle GA e delle CK in maniera tale da mantenere alti i livelli di CK e bassi i livelli di GA bioattive nelle cellule che lo compongono. Il clonaggio di geni GA20ox e GA2ox di H. annuus ci ha permesso di studiare in parallelo l’attività trascrizionale di geni KNOX e di geni del metabolismo delle GA in un clone dell’ibrido interspecifico Helianthus annuus × H. tuberosus (EMB-2) che sviluppa meristemi ectopici sulla superficie adassiale delle foglie. I risultati ottenuti hanno evidenziato che l’epressione di tre geni KNOX di classe 1 (HtKNOT1, KN1 e KN2) è implicata nello sviluppo di queste formazioni epifilliche. Al contrario di quanto atteso tuttavia, i livelli dei trascritti di HaGA20ox1 e HaGA20ox2 rilevati nelle foglie epifilliche di EMB-2 sono risultati essere aumentati o invariati rispetto a quelli evidenziati nelle foglie del controllo, mentre l’accumulo di trascritti di HaGA2ox1 nelle foglie epifilliche risultava invariato o ridotto rispetto alle foglie non epifilliche. La differenziazione di strutture ectopiche da cellule differenziate è solo uno degli aspetti morfologici della “sindrome” indotta dalla sovra-espressione dei geni KNOX spesso accompagnata da una evidente riduzione di taglia, aumento delle ramificazioni, alterazioni della morfologia fogliare (passaggio da foglia semplice a foglia composta), caratteri non osservati frequentemente in piante di EMB-2 allevate in vivo. In EMB-2 la sovra-espressione di HtKNOT1 si manifesta unicamente in siti specifici come i vasi conduttori e le cellule dell’epidermide della superficie adassiale delle foglie deputate a sviluppare i meristemi e gli embrioni avventizi. Per questo motivo, per avere una visione più chiara sul tipo di relazione che intercorre tra geni del metabolismo delle GA e i geni KNOX di classe1 nel mutante EMB-2, saranno necessari ulteriori analisi di ibridazione in situ dei geni isolati. Inoltre risulterebbe sicuramente vantaggioso l’isolamento di un maggior numero di geni KNOX di classe1 e di tutti gli elementi che compongono le famiglie multigeniche delle GA 20- e GA 2-ossidasi di girasole.<br>Le GA intervengono in varie fasi dello sviluppo e della crescita di una pianta e l’isolamento di geni codificanti enzimi del loro metabolismo ha permesso di recente un forte progresso nella conoscenza della biosintesi, regolazione e attività di questa classe di ormoni vegetali. Allo stesso modo l’adozione di diversi sistemi vegetali di importanza economica come il girasole, in cui studiare i vari aspetti legati ai meccanismi molecolari alla base della risposta delle piante alle GA e della loro regolazione potrebbe accelerare anche la conoscenza dei vari elementi che caratterizzano questi processi e dare la possibilità di conoscere l’importanza relativa che questi elementi rivestono nelle varie specie anche in vista di prospettive applicative.<br><br>
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