• meccanotrasduzione
• crescita direzionale
• contrattilità intracellulare
• adesioni focali
• Nanogratings
• YAP/TAZ

Negli ultimi anni nel campo della medicina rigenerativa c’è crescente richiesta di scaffolds che possano favorire la crescita direzionale delle cellule, ad esempio per promuovere la rigenerazione nervosa periferica. In tale ambito substrati con topografia a nanograting (caratterizzati da alternanza di dossi -ridge- e valli –groove-) si sono dimostrati efficienti nell’indurre stimoli direzionali alle cellule. Grazie al processo della meccanotrasduzione, che vede come principali protagonisti integrine, adesioni focali (FA) e citoscheletro, le cellule percepiscono la topografia esterna e attivano vari pathway intracellulari che modulano diversi processi cellulari (es. differenzazione, motilità). Recentemente sembra rivestire un ruolo importante in tale ambito anche il complesso proteico YAP/TAZ, che agisce da co-attivatore trascrizionale.
Nel mio lavoro di tesi ho sviluppato, mediante la tecnica di Thermal Nanoimprint Lithography, dei substrati nanostrutturati termoplastici con periodicità di 1000, 600, 400 e 200 nm (dove la larghezza del dosso più la larghezza della valle definisce il periodo) al fine di valutare il limite inferiore di dimensione efficace per la guida da contatto di un modello cellulare di tipo neuronale (i.e cellule PC12 differenziate con NGF). Ho cresciuto le cellule sui substrati e ho misurato l’allineamento dei neuriti rispetto alla topografia; successivamente, individuata la dimensione di periodo minima affinché le cellule possano leggere la direzionalità del pattern e sviluppare i neuriti allineati ad esso, ho indagato i meccanismi molecolari che stanno alla base di tale comportamento. Ho quindi analizzato le adesioni focali sia dal punto di vista morfologico che molecolare, misurandone la maturazione e lo stato di attivazione. Mediante farmaci che agiscono sulla contrattilità acto-miosinica del citoscheletro, ho valutato la possibilità di modulare la guida da contatto neuronale su questi substrati. Infine ho valutato se la via di YAP/TAZ fosse implicata nella guida da contatto: ho analizzato il livello di espressione di YAP/TAZ, mediante western blot, e la sua localizzazione cellulare (nucleare/citoplasmatica) mediante immunocitochimica e microscopia confocale a fluorescenza nelle diverse condizioni.
In questo studio è stato individuato il limite inferiore per la guida da contatto di cellule PC12, rappresentato dal substrato T400 (200nm larghezza dei dossi, 200nm larghezza delle valli e profondità 200nm). Sui substrati con periodicità < 400 nm si ha un ridotto allineamento dei neuriti ed un cambiamento nella maturazione delle FA. Per quanto riguarda il livello d’espressione di proteine appartenenti alle FA, riducendo la periodicità dei nanograting (da 1000nm a 200nm) è stato possibile osservare una tendenza di riduzione del livello di Zyxina, proteina caratteristica delle FA mature. Inoltre è stato osservato che, utilizzando Nocodazolo e Blebbistatina, la capacità di guida dei neuriti sui substrati può essere modulata, rispettivamente in modo positivo e negativo. Infine la localizzazione di YAP/TAZ nucleare risulta essere maggiore sui substrati nanostrutturati rispetto alla superficie isotropica (FLAT). In presenza sia di Nocodazolo che di Blebbistatina la localizzazione di YAP/TAZ rimane principalmente nucleare. In conclusione è possibile affermare che le cellule PC12 differenziate reagiscono attivamente alla topografia sottostante modulando il processo di maturazione, stabilizzazione e distribuzione delle FA che si riflette nello sviluppo di neuriti allineati o meno alla direzione del grating e quindi nella capacità di mettere in atto la guida da contatto. È stata confermata inoltre l’importanza dell’integrità acto-miosinica del citoscheletro sia per la guida da contatto delle cellule PC12 sui NG che per l’attivazione di YAP/TAZ, che risulta maggiore sui substrati nanostrutturati, dove viene indotta una forte tensione intracellulare, rispetto alla superficie isotropica FLAT. La permanenza nucleare di YAP/TAZ anche successivamente alla somministrazione della Blebbistatina, inibitore della contrattilità acto-miosinica, potrebbe essere dovuta ad una stiffness del substrato (>2GPa) che porta ad una costitutiva attivazione del complesso indotta prima dell’aggiunta del farmaco.