• TfR
• phage display
• aptameri peptidici
• transferrina

Negli ultimi decenni, con l'avvento delle nanotecnologie, si sono aperte importanti prospettive nell'ambito dello sviluppo di nuovi sistemi di drug delivery per la veicolazione selettiva dei farmaci all'interno dell’organismo. Un sistema di delivery ideale deve essere in grado di riconoscere con elevata affinità e selettività uno specifico bersaglio molecolare, minimizzando nel contempo le interazioni aspecifiche. In questo contesto uno dei target più promettenti è il recettore della transferrina (TfR), una proteina di membrana sovraespressa in molti tumori solidi e che rappresenta quindi un bersaglio interessante per la veicolazione selettiva di farmaci antitumorali.
Nel corso degli ultimi anni sono state studiate varie strategie per realizzare il targeting del TfR, basate principalmente sull'impiego di anticorpi ed aptameri oligonucleotidici. Una strategia alternativa prevede l'impiego di sequenze in grado di sfruttare il ligando naturale del recettore, la transferrina, mantenendo inalterate le sue proprietà biologiche e conseguentemente la capacità di interazione con il TfR.
L'aptamero peptidico Tf2, un breve peptide di sei amminoacidi (HKYLRW), è stato selezionato per tale scopo tramite studi computazionali in modo da mostrare una buona affinità nei confronti della transferrina. Tale peptide è in grado di legare la transferrina in un dominio diverso rispetto a quello con cui quest'ultima interagisce con il suo recettore e con il ferro. L'utilizzo del Tf2 in sistemi di drug delivery fa sì che la transferrina, presente fisiologicamente nel flusso sanguigno, si leghi spontaneamente al peptide e venga esposta sulla superficie dei nanosistemi con un'orientazione favorevole affinché essa possa interagire con il TfR e svolgere la sua naturale funzione, ovvero legarsi al recettore ed essere internalizzata mediante endocitosi. Questo targeting indiretto rappresenta una valida alternativa per superare i problemi relativi all'introduzione di sistemi nanostrutturati nel circolo sanguigno, in particolare la solvatazione delle nanosrutture ad opera delle proteine seriche (protein corona), che spesso limita drasticamente l'efficacia delle sequenze di targeting attivo in vivo.
Il lavoro di tesi ha trattato l'ottimizzazione sperimentale della sequenza dell'aptamero peptidico Tf2, allo scopo di migliorarne l'efficienza di targeting nei confronti della transferrina. Per questo è stata utilizzata una delle tecniche sperimentali di selezione di aptameri peptidici, il phage display, che sfrutta i fagi filamentosi come strumenti in grado di esporre sulla loro superficie una library peptidica. Inizialmente, è stata costruita una library di sequenze codificanti per peptidi di sei amminoacidi, contenente tre residui amminoacidici del peptide Tf2 ritenuti fondamentali per il legame alla transferrina. Tramite tre cicli di panning sono stati selezionati alcuni peptidi caratterizzati da una buona affinità per la transferrina. I peptidi selezionati sono stati poi sintetizzati tramite sintesi peptidica su fase solida e le loro proprietà di binding nei confronti della transferrina e della BSA, utilizzata come modello di binding aspecifico, sono state valutate mediante misurazioni con una microbilancia a cristalli di quarzo (QCM-D). Questa procedura ha permesso di individuare un peptide, il Tf2-Opt2, dotato di elevata affinità nei confronti della transferrina e caratterizzato da una bassa adesione aspecifica. È stato quindi valutato il comportamento del Tf2-Opt2 in vitro, studiandone tramite microscopia confocale l'internalizzazione in cellule di adenocarcinoma pancreatico (MiA PaCa-2), al seguito della coniugazione con il fluoroforo Atto633. Infine, è stata valutata la capacità di questo peptide ottimizzato di promuovere l'internalizzazione in cellula di sistemi nanostrutturati, quali le nanoparticelle di oro.