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Il lavoro descritto nella presente tesi è volto alla progettazione di un sistema microarray che permetta di genotipizzare più di un centinaio di polimorfismi in geni candidati ad essere implicati nella modulazione della risposta al trattamento con antidepressivi.
I farmaci antidepressivi, pur rappresentando il trattamento di elezione per la depressione, si rivelano inefficaci nel 35-40% dei pazienti (Thase, 2001; Thase et al., 2001; Bauer et al., 2002), causando sofferenze personali, ma anche costi considerevoli per la società (Kirchheiner et al., 2003). Un contributo importante alla mancata risposta agli antidepressivi è dato dal profilo genetico dei pazienti trattati. Variazioni polimorfiche a livello dei geni implicati nei pathway farmacocinetici possono comportare un metabolismo alterato di queste molecole e quindi una loro relativa inefficacia, oppure, all’opposto, effetti collaterali importanti. Varianti nei geni coinvolti nella farmacodinamica degli antidepressivi, invece, possono implicare un mancato raggiungimento dei bersagli terapeutici (Melmon and Morelli, 1992).
Il lavoro di questa tesi ha avuto inizio con una ricerca approfondita nell’ambito di database specializzati quali PubMed, OMIM, Kegg, GeneCards, allo scopo di individuare quali fossero i geni maggiormente coinvolti nella risposta agli antidepressivi. I geni identificati come probabili “candidati” sono stati raggruppati in classi funzionali alle quali è stato dato un ordine di priorità sulla base della relazione con il fenomeno oggetto di studio. All’interno di ogni classe i geni sono stati, poi, gerarchicamente classificati in base alle informazioni derivanti dagli studi di associazione presenti in letteratura. In questo modo sono stati individuati anche alcuni polimorfismi la cui importanza come candidati è stata ulteriormente valutata in base all’impatto che avevano sul prodotto proteico e in base alla loro frequenza nella popolazione caucasica (>5%). La lista dei polimorfismi è stata successivamente implementata con i dati ottenuti dai database NCBI e HapMap. In totale sono state selezionate 138 varianti di sequenza in 22 geni.
Il lavoro di tesi è poi proseguito con la ricerca di un metodo sperimentale sensibile e ad alta processività che consentisse di genotipizzare tutti i polimorfismi selezionati. La scelta è ricaduta su un metodo che combina l’azione dell’enzima ligasi su sonde denominate padlock con l’ibridazione su microarray (Baner et al., 2003; Hardenbol et al., 2003; Szemes et al., 2003). L’approccio si propone di accoppiare l’elevato grado di specificità della ligasi con una piattaforma ad alta processività quale quella microarray, che permette di analizzare centinaia di polimorfismi contemporaneamente. Sono stati, quindi, disegnati tutti gli elementi necessari per la “fase sperimentale” quali i primer per la PCR, tramite il software Primer3, e le sonde padlock, con il programma Probemaker (Stenberg et al., 2005). Con Probemaker ed OligoAnalyzer sono state condotte, infine, prove sperimentali simulate al fine di ottimizzare la procedura.
Il presente lavoro si configura come la fase preliminare di un progetto più ampio che prevede la realizzazione di uno studio di associazione che porterà ad identificare i polimorfismi maggiormente coinvolti nel meccanismo di risposta agli antidepressivi.
I risultati ottenuti con lo studio di associazione potranno essere utilizzati per la realizzazione di un test predittivo del tipo di risposta agli antidepressivi, che consentirà di personalizzare il trattamento della depressione sulla base del profilo genetico di ciascun paziente. Attualmente in commercio esiste già un test di questo tipo: l’AmpliChip, che però verte solo su un numero limitato di geni appartenenti alla famiglia del citocromo P-450 ed è responsabile esclusivamente della farmacocinetica degli antidepressivi. Le varianti selezionate per tale test, inoltre, non rappresentano quelle maggiormente frequenti nella popolazione caucasica, rendendo così poco efficace il suo utilizzo sulla popolazione europea.