• campioni urina
• ponti disolfuro
• mieloma multiplo
• elettroforesi
• catene leggere libere

Il mieloma multiplo, appartenente alle gammopatie monoclonali, è caratterizzato dalla proliferazione incontrollata di un clone plasmacellulare che produce un’immunoglobulina intatta e identica per caratteristiche isotipiche e idiotipiche e/o catene leggere libere (free light chains, FLC) rilevabili nel siero e/o nelle urine.
La diagnosi di pazienti affetti da mieloma multiplo prevede l’elettroforesi delle sieroproteine, l’immunofissazione delle proteine nel siero e nelle urine, la quantificazione delle FLC nel siero. Per la quantificazione delle FLC sono disponibili commercialmente due saggi immunochimici: saggio Freelite (The Binding Site, Regno Unito), saggio N-Latex (Siemens, Germania). Sebbene i due saggi sembrano essere equivalenti dal punto di vista diagnostico, possono fornire risultati discordanti per lo stesso campione perciò è importante che un paziente sia seguito utilizzando la stessa metodica nello stesso laboratorio diagnostico.
Nel siero sono state trovate diverse forme di aggregazione diverse per le FLC-κ (prevalentemente nella forma di monomero o di dimero) e per le FLC-λ (prevalentemente nella forma di dimeri o di oligomeri).
Uno studio preliminare suggerisce che i diversi risultati ottenuti con i due saggi immunologici siano dovuti ad una diversa reattività nei confronti di oligomeri di FLC pertanto è importante conoscere la distribuzione degli stati di aggregazione di FLC nel circolo sanguigno.
Lo scopo dell’elaborato di tesi è di studiare le diverse forme di aggregazione di FLC in campioni di urina ottenuti da pazienti affetti da mieloma multiplo. La scelta del campione urinario deriva dal fatto che si tratta di un fluido biologico di composizione più semplice e di ridotto contenuto proteico e quindi più facile da analizzare rispetto a un campione di siero .
Sono stati raccolti 58 campioni di urina presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’Azienda Ospedaliera Pisana da Febbraio a Novembre 2016 e ne sono stati caratterizzati 32 che presentavano all’immunofissazione esclusivamente catene leggere libere di tipo κ o λ. Le forme di aggregazione delle FLC sono state studiate in SDS-PAGE, in condizioni riducenti o meno, associata al western blot.
Dai risultati è emerso che le FLC di tipo κ e λ si trovano sotto forma di monomeri e di oligomeri. I monomeri FLC-λ hanno un PM apparente di 25 kDa indipendentemente dalle condizioni riducenti o non. I monomeri FLC-κ hanno un PM apparente di 20 kDa. La diversa mobilità elettroforetica del monomero κ si pensa esser dovuta alla presenza di un ponte disolfuro intra-catena che permette una conformazione tale da conferirgli una maggiore mobilità elettroforetica attraverso il gel di poliacrilammide. In condizioni riducenti il monomero κ mostra una mobilità elettroforetica del PM atteso di 25 kDa.
Gli oligomeri per entrambe le FLC mostrano un PM apparente di 37 kDa, 50 kDa, 75 kDa e sono stabilizzati da ponti disolfuro poiché si risolvono in un’unica banda in corrispondenza dei 25 kDa sotto l’azione riducente del β-mercaptoetanolo.
Negli esperimenti condotti è stato notato che i campioni corsi in condizioni non riducenti presentano una deformazione laterale in corrispondenza dei 25 kDa. Tale artefatto potrebbe essere dovuto al parziale effetto denaturante del detergente SDS che potrebbe interferire con la mobilità elettroforetica della proteina in esame. Non si può neanche escludere che durante l’elettroforesi sia avvenuta una parziale diffusione del β-mercaptoetanolo presente nei campioni caricati in corsie adiacenti. Questo aspetto dovrà essere verificato utilizzando durante la preparazione del campione l’N-etilmaleimmide (NEM), un composto organico che a pH compreso tra 6.5 e 7.5, è in grado di legarsi ai gruppi tiolo liberi.
E’ stato inoltre verificato se la diversa matrice biologica possa influire sulla forma di aggregazione delle FLC confrontando il campione di urina e di siero appartenenti allo stesso paziente ottenuti nella stessa data. I dati preliminari indicano che la matrice urinaria sembrerebbe non alterare le forme di aggregazione delle FLC presenti nel circolo sanguigno. Pertanto lo studio condotto sui campioni di urina sembra essere rappresentativo delle catene leggere libere sieriche.