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• Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis è un batterio Gram-positivo, ubiquitario, sporigeno, di forma bastoncellare e mobile per la presenza di flagelli peritrichi. Questo microrganismo viene ampiamente impiegato come biopesticida per la sua capacità di produrre cristalli parasporali ad azione insetticida. La dispersione nell’ambiente di ingenti quantità di spore di questo microrganismo è giustificata dalla scarsa rilevanza che presenta come patogeno per i mammiferi. Durante gli ultimi anni, tuttavia, numerose osservazioni hanno evidenziato che questo microrganismo può provocare occasionalmente varie infezioni nell’uomo, tra cui intossicazioni alimentari, periodontiti e batteriemie, infezioni oculari, di ustioni o di ferite. B. thuringiensis, infatti, è filogeneticamente molto simile a Bacillus cereus e, come questo microrganismo, è in grado di produrre un’ampia varietà di fattori di virulenza come fosfolipasi C specifiche per fosfatidilcolina o fosfatidilinositolo (PC-PLC e PI-PLC), emolisine, in particolare emolisina BL (HBL), e varie enterotossine. Altri fattori di virulenza, come la motilità cellulare ed il differenziamento swarming, ovvero la capacità di migrazione di comunità batteriche su superfici solide, sono ancora oggetto di studio. Il differenziamento swarming, in particolare, potrebbe concorrere alla virulenza di questo microrganismo, dato che, in altre specie batteriche, è stata dimostrata una associazione tra swarming ed incremento nella secrezione di proteine di virulenza.
Il presente lavoro di tesi si è prefisso l’obiettivo di comprendere se, in B. thuringiensis, esistesse una correlazione genetica e fenotipica tra swarming e produzione di proteine di virulenza e se lo swarming avesse un ruolo diretto nella patogenicità di questo microrganismo. A tale scopo, sono stati utilizzati: il ceppo di riferimento 407 di B. thuringiensis e sei mutanti di questo ceppo ottenuti per mutagenesi inserzionale (MP10, MP11, MP12, MP13, MP14, MP15) prodotti precedentemente e portanti delezioni nei geni BT2787, BT2969, BT0713, BT3576, BT5364, BT3422, rispettivamente.

Una prima analisi fenotipica di tali ceppi, comparativamente al ceppo parentale, ha permesso di evidenziare che il ceppo mutante MP13 mostra alcune differenze nella curva di crescita in uno dei terreni saggiati.
Per tutti i ceppi è stata valutata sia la motilità cellulare in mezzo liquido che la motilità swarming su mezzo solido di crescita e tutti i mutanti sono risultati mobili ma completamente incapaci di produrre colonie swarming.
Il potenziale patogenetico di ciascun ceppo è stato analizzato valutando la secrezione di fattori di virulenza, quali emolisina BL (HBL), fosfolipasi C (PC-PLC) e produzione di proteasi extracellulari. La quantificazione dell’emolisina BL secreta è stata valutata impiegando il kit commerciale BCET-RPLA. La quantificazione della PC-PLC è stata effettuata mediante saggio di diffusione in agar contenente tuorlo d’uovo, mentre l’analisi delle proteasi, tramite semina su piastre Petri contenenti agar e latte in polvere (terreno skim-milk). Inoltre, mediante SDS-PAGE su gel di poliacrilamide, sono stati valutati i profili proteici di sopranatanti di coltura dei ceppi mutanti comparativamente al ceppo parentale.
Tali indagini evidenziano che due dei ceppi mutanti presentano una ridotta secrezione della fosfolipasi C (PC-PLC) rispetto al ceppo parentale, mentre non sono state riscontrate differenze significative nella secrezione degli altri fattori. Infine, lo studio della capacità di produrre biofilm in vitro non ha permesso di evidenziare differenze significative tra i ceppi mutanti e il parentale.
L’insieme dei risultati non ha permesso di evidenziare importanti alterazioni del potenziale patogenetico dei ceppi difettivi nel differenziamento swarming. Dato che lo swarming è una proprietà che potrebbe costituire un valore aggiunto nella virulenza batterica in vivo, è stato allestito un modello di infezione animale con i ceppi oggetto del presente studio. A questo scopo, larve di Galleria mellonella sono state infettate con diverse dosi infettanti e la mortalità indotta dai singoli ceppi, seguita nel tempo. Questa indagine ha permesso di valutare che la dose letale 50 (DL50) risulta significativamente aumentata in tutti i mutanti rispetto al ceppo parentale.