• endo-PG
• Trichoderma virens
• Phaseolus vulgaris
• Solanum lycopersicum
• Arabidopsis thaliana
• PGIP
• RT-PCR
• biofitofarmaci

La ricerca di metodi alternativi alla lotta chimica ai patogeni delle piante mediante l’utilizzo di microrganismi ha subito, in particolar modo negli ultimi anni, una notevole espansione. Gli agenti di biocontrollo sono molto vantaggiosi in quanto totalmente privi di rischi per la salute umana e ad impatto ambientale praticamente trascurabile.
Nel presente lavoro di tesi è stato preso in esame il ceppo I10 di Trichoderma virens, specie fungina che riveste notevole importanza in ambito biotecnologico in quanto promotore della crescita vegetale, agente di biocontrollo dei fitopatogeni ed induttore di resistenza. Trichoderma riveste un ruolo importante nel controllo biologico delle colture grazie alle sue caratteristiche fisiologiche ed ecologiche: questo microorganismo instaura un’associazione di tipo simbiotico, opportunistico ed avirulento, con la pianta colonizzandone le radici e dovendo perciò penetrare all’interno delle cellule vegetali. Il primo ostacolo alla penetrazione è costituito dai primi strati della parete, ricchi in pectina: tra gli enzimi che degradano la parete cellulare (CWDE: Cell Wall Degrading Enzymes), i pectinolitici sono tra i primi ad essere prodotti. Le endopoligalatturonasi (endoPG), i più efficaci tra gli enzimi peptici, possono avere un ruolo pre-elicitante per lo sviluppo della resistenza, mediante la liberazione di oligogalatturonidi (elicitori) dai costituenti della parete vegetale.
Sulla base di queste premesse e dei risultati ottenuti in lavori pregressi, lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di analizzare l’interazione che il fungo instaura con le radici di Phaseulus vulgaris, Arabidopsis thaliana e Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom dal punto di vista molecolare.
Per la realizzazione delle analisi sono stati utilizzati due diversi sistemi sperimentali:
• Interazione pianta-fungo su perlite in Vasi Microbox da colture in vitro (per Phaseulus vulgaris e Arabidopsis thaliana)
• Interazione pianta-fungo su dischi di chellopane in piastre Petri (per Arabidopsis thaliana e Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom)
Il primo sistema sperimentale consente l’accrescimento di T. virens direttamente sulle radici delle diverse plantule; nel secondo le piantine vengono fatte interagire con il fungo adagiando su di esse un disco di chellopane contenente il micelio fungino, precedentemente cresciuto in incubatore. Nel secondo sistema i due organismi interagiscono pur rimanendo separati dai dischi, così da permettere la raccolta di campioni molto più puliti rispetto al sistema in perlite.
Per quanto riguarda pomodoro si sono confrontati i risultati ottenuti in piastra con quelli scaturiti da un precedente lavoro di tesi, realizzato in un sistema sperimentale analogo a quello in perlite utilizzato in questo lavoro. Per Arabidopsis invece si sono realizzate prove in entrambe i sistemi sperimentali considerati. L’associazione molecolare tra T. virens e Fagiolo è stata studiata solamente in perlite.
E’ stata indagata l’interazione molecolare che si stabilisce fra T. virens e le radici vegetali delle diverse specie di piante, con particolare attenzione alla degradazione della parete cellulare vegetale da parte del fungo ed alla eventuale reazione inibitoria da parte della pianta che può rappresentare una risposta di resistenza. Allo scopo è stata valutata l’espressione di 2 geni (Tvpg1 ed Tvpg2) codificanti per endopoligalatturonasi in T. virens e l’induzione di:
• un gene (corrispondente a Lepgip1, già identificato in pomodoro) codificante per una proteina inibitrice delle endopoligalatturonasi in S. lycopersicum.
• due geni (corrispondenti a bpgip1 e bpgip2, precedentemente identificati in fagiolo) codificanti per due proteine inibitrici delle endopoligalatturonasi in P. vulgaris.
• due geni (corrispondenti a pgip1 e pgip2, precedentemente identificati in Arabidopsis) codificanti per due proteine inibitrici delle endopoligalatturonasi in A. thaliana.
Uno dei due geni del fungo, Tvpg2, è risultato costitutivo in quanto espresso in tutte le condizioni saggiate, inclusi i controlli, in tutti e due i sistemi sperimentali adottati.
Relativamente al gene Tvpg1, in una precedente tesi si era osservata, nelle analisi relative all’interazione tra T. virens e S. lycopersicumin in perlite, un’evidente induzione dell’espressione genica fra le 48 e le 72 ore dall’inoculazione del fungo sull’apparato radicale della pianta; allo stesso intervallo di tempo era stata registrata l’espressione del gene Lepgip1 di S. lycopersicum nelle radici inoculate con T. virens. In questo lavoro non si è potuta confermare l’induzione del suddetto gene fungino nell’interazione con pomodoro, saggiata questa volta in un sistema diverso (piastra Petri), in quanto esso non è risultato espresso a nessun tempo nei campioni indotti testati e neppure nei controlli. Non si è riscontrata l’espressione del gene Tvpg1 neppure nei campioni indotti relativi alle altre piante saggiate: i dati ottenuti in questo lavoro suggeriscono la mancata induzione del gene da parte delle radici di pomodoro, nel nuovo sistema testato, e delle altre piante utilizzate, in entrambe i sistemi sperimentali adottati.
Per quanto riguarda i geni di pianta codificanti per inibitori delle endopoligalatturonasi, ad esclusione di pomodoro per cui non è mai stata osservata l’espressione del gene Lepgip1, sono stati ottenuti i seguenti risultati:
• P. vulgaris → il gene bpgip1 sembra essere costitutivo in quanto si è rilevata la presenza del trascritto ad ogni tempo di campionamento considerato e nel controllo della pianta; il gene bpgip2 presenta lo stesso pattern di espressione risultando anch’esso di tipo costitutivo.
• A. thaliana → il gene pgip1 sembra inducibile siccome si è rilevata la presenza del trascritto a 24 ore dall’inoculazione, nel sistema sperimentale in perlite, e a 48 ore nel sistema in piastra Petri, mentre la banda attesa risulta invece assente a tutti gli altri tempi saggiati e nel controllo della pianta; il gene pgip2 è risultato costitutivo in tutti e due i sistemi sperimentali adottati: il trascritto è stato rilevato nei campioni indotti, a tutti e quattro i tempi considerati, e nel controllo della pianta.
Le differenze di timing riscontrate nell’espressione del gene pgip1 di Arabidopsis nei due sistemi sono probabilmente dovute alle caratteristiche intrinseche dei due metodi: in perlite, dove il contatto tra i due organismi è diretto, l’espressione del gene in questione si verifica all’incirca 24 ore prima rispetto al sistema in piastra Petri.
Ulteriori indagini sono necessarie per avvalorare questi risultati e confermare l’esistenza di una comunicazione molecolare, tra il fungo e le piante prese in considerazione, che coinvolge le funzioni geniche analizzate.