• Saccharomyces cerevisiae
• terapia genica
• virus adeno-associato
• espressione proteine virali in lievito

Il virus Adeno-associato (AAV), piccolo virus con DNA a singolo filamento di 4,7Kb, fa parte della famiglia dei Parvoviridae. AAV è un virus difettivo, cioè richiede fattori esogeni, forniti da un virus helper (Adenovirus, Herpes Simplex virus, Vaccinia virus o Papilloma virus), per portare a termine il ciclo litico. In assenza del virus helper, AAV si integra ed esprime i suoi geni a livelli molto bassi. Quando la cellula è co-infettata anche dal virus helper, il genoma di AAV viene escisso dal DNA genomico, replicato e assemblato in particelle virali. I vantaggi di questo virus, che lo portano ad essere molto utilizzato come vettore nella terapia genica, sono la non patogenicità per l'uomo e la capacità di infettare cellule che non si dividono. Uno svantaggio legato all’uso del virus per la terapia genica sta nella difficoltà di ottenere alto titolo virale. In laboratorio è in atto un progetto per esplorare la possibilità di produrre il virus AAV nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il lievito è un organismo molto utilizzato per studiare i virus ed è stato usato con successo per produrre vari virus tra cui il Papilloma virus.
Lo scopo di questa tesi è quello di far esprimere nel lievito Saccharomyces cerevisiae due proteine di Adenovirus, E4orf6 e E1b55k, e di valutarne gli effetti sulla replicazione di AAV. Si pensa che le due proteine E4orf6 e E1b55k formino un complesso che aiuti la conversione del genoma di AAV da single strand a double strand e che favorisca l'assemblaggio e la stabilità delle particelle virali. Abbiamo quindi clonato i due geni di Adenovirus, E4orf6 e E1b55k, in un plasmide di espressione nel lievito, pESCKan, sotto il controllo dei promotori inducibili GAL1 e GAL10. Una volta ottenuti i plasmidi li abbiamo trasformati nel ceppo di lievito RSY12, sia in presenza che in assenza del gene Rep68 di AAV. Rep68 è una delle quattro proteine di AAV necessarie per la replicazione del virus.
L’espressione delle proteine è stata analizzata per mezzo di Western blot. Già dopo induzione di 4 ore in mezzo contenente galattosio è possibile vedere nella parte solubile sia la proteina E4orf6 che E1b55k. Un ulteriore analisi di caratterizzazione è stata quella di valutare l’effetto dell’espressione delle due proteine sulla vitalità del lievito in presenza e in assenza di Rep68. Dopo avere cresciuto le cellule per 16-24 ore in mezzo completo con glucosio, le abbiamo in parte piastrate in mezzo completo contenente glucosio o galattosio, e in parte indotte in mezzo contenente galattosio e successivamente piastrate in mezzo completo con glucosio. In entrambi i casi abbiamo osservato una riduzione della sopravvivenza al 30% quando E4orf6 e E1b55k sono espresse in presenza di Rep68. In seguito, per valutare l’effetto delle due proteine sulla replicazione di AAV, abbiamo eseguito esperimenti di Southern blot su DNA estratti da ceppi di lievito che esprimono le suddette proteine e trasformati con un vettore AAV per determinare l’effetto di E4orf6 e E1b55k sulla replicazione di AAV. I risultati di Southern suggeriscono che in presenza di E4orf6 ed E1b55k la banda relativa al DNA a singolo filamento è più intensa rispetto alle altre bande a peso molecolare maggiore. Queste osservazioni suggeriscono un effetto della presenza di E4orf6 ed E1b55k sulla formazione di ssDNA.