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• live cell imaging
• mRNA localization
• mRNA localizzazione

La localizzazione intracellulare degli mRNA rappresenta un importante meccanismo di regolazione genica post-trascrizionale, coinvolto sia nella diversificazione del destino cellulare che nella determinazione della polarità cellulare. Finalità della mia tesi è la messa a punto di un metodo innovativo per studiare in vivo la distribuzione intracellulare di RNA messaggeri allo scopo di effettuare un’analisi della loro segregazione durante le divisioni cellulari che accompagnano la retinogenesi nell’anfibio Xenopus laevis. Il sistema sperimentale che ho utilizzato si basa su due componenti: la proteina MS2-GFP, derivata dalla fusione della proteina batteriofagica MS2 con proprietà “RNA-binding”, con la proteina fluorescente verde GFP, dotata di un segnale di localizzazione nucleare; un mRNA reporter contenente un sito di legame per la proteina MS2-GFP, costituito da più ripetizioni di un’unità “stem-loop” (ripetizioni MS2), poste a monte del 3’UTR di un gene di interesse. La proteina MS2-GFP, riconoscendo le ripetizioni MS2, rimane associata all’mRNA reporter nel citoplasma, permettendone la visualizzazione in vivo mediante osservazione al microscopio ad epifluorescenza o al microscopio confocale. Questo metodo si rivela un utile strumento per seguire la dinamica di trasporto e di localizzazione degli RNA messaggeri con una risoluzione temporale e spaziale più fine rispetto a quelle consentite dai tradizionali approcci di studio che, richiedendo la fissazione delle cellule, forniscono un’immagine statica della presenza degli RNA. Durante la mia tesi, ho preparato una serie di costrutti: ho clonato nel vettore di espressione pCS2+ la sequenza codificante per la proteina di fusione MS2-GFP, dotata all’estremità C-terminale di un segnale di localizzazione nucleare (NLS); ho preparato inoltre altri costrutti in pCS2+ contenenti 6 o 24 ripetizioni MS2, poste a monte della sequenza 3’ UTR di alcuni geni di interesse come Rab-13, Xotx2 e Xotx5b. Per mettere a punto il sistema ho effettuato una serie di trasfezioni nella linea cellulare HN9.10e, derivante dalla fusione somatica di cellule ippocampali di topo con un neuroblastoma murino: il solo plasmide pCS2+-MS2-GFP mostra, come atteso, un segnale strettamente nucleare. La co-trasfezione del plasmide pCS2+-MS2-GFP con il costrutto contenente 24 ripetizioni MS2 più il 3’UTR di Rab13 o il 3’UTR di Xotx2, determina lo spostamento della proteina reporter nel citoplasma dei neuroblasti. In particolare, il trascritto Xotx2 risulta localizzato a livello di alcune protrusioni cellulari, suggerendo che il suo mRNA possa essere asimmetricamente distribuito nel citoplasma neuronale. In futuro, intendiamo applicare questo metodo sperimentale all’analisi della localizzazione intracellulare degli mRNA di Xotx2 e Xotx5b durante la retinogenesi di Xenopus, mediante lipofezione dei costrutti nella vescicola ottica di embrioni a stadio di neurula precoce e successiva analisi della segregazione di questi trascritti durante le divisioni cellulari che accompagnano il differenziamento dei tipi cellulari retinici.