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La berberina (5,6-dihydro-9,10-dimethoxy-benzo[g]-1,3-benzodioxolo[5,6-a] quinolizinium) è un alcaloide isochinolico di origine naturale isolata da erbe medicinali come la Berberis vulgaris, Berberis aquifolium, Hydrastis canadensis e Coptis chinensis per molto tempo utilizzata nella medicina tradizionale cinese e ayurvedica per contrastare infezioni e altri stati patologici. Studi recenti ne hanno dimostrato le enormi potenzialità farmacologiche che potrebbero rivelarsi utili per lo sviluppo di strategie terapeutiche volte a contrastare diverse malattie. Essa infatti possiede effetti antinfiammatori, ipoglicemizzanti, antiiperlipidemici, antiangiogenici, neuroprotettivi, cardiotonici, antiaritmici, etc. Inoltre, numerosi studi hanno dimostrato che la berberina può influenzare le più importanti vie di segnalazione, come ad esempio la via del fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF) e molte altre. Attualmente, la berberina viene già considerata relativamente sicura ed è impiegata come integratore alimentare volto a contrastare i livelli elevati di glicemia e colesterolo nei paesi occidentali. Scarsi e contraddittori sono invece i dati riguardanti gli effetti della berberina sullo sviluppo embrionale.
Lo scopo della tesi è stato quello di incrementare le conoscenze riguardanti gli effetti della berberina sulla morfogenesi e sulla funzionalità del sistema cardiovascolare, utilizzando come animale modello il pesce teleosteo zebrafish (Danio rerio). Negli ultimi anni è notevolmente aumentato l’utilizzo di zebrafish come sistema modello nello screening iniziale di diverse molecole/composti/farmaci con potenzialità terapeutiche, così come nello studio di diverse patologie e dei processi di sviluppo. Molteplici sono, infatti, gli aspetti sperimentali vantaggiosi nell’uso dello zebrafish, come ad esempio: l'elevata omologia del suo genoma con quello umano, il fatto che molti geni coinvolti in patologie umane abbiano il loro corrispettivo in zebrafish, la fecondità elevata, la disponibilità di uova/embrioni facilmente manipolabili e trasparenti nelle fasi precoci dello sviluppo. In particolare, in questo studio sono stati utilizzati zebrafish della linea transgenica Casper che risultano trasparenti anche a stadio di sviluppo avanzati, ad eccezione dell’epitelio pigmentato retinico, sia wt che/o Tg(kdrl:EGFP), quest’ultimi con il vantaggio che oltre ad essere trasparenti sviluppano vasi fluorescenti. Il protocollo sperimentale è stato condotto in accordo con precedenti lavori, e con un’indagine (non pubblicata) condotta in precedenza nel nostro laboratorio che ha consentito di individuare una concentrazione sub-letale di berberina (al di sotto della concentrazione letale mediana, LC50) in grado di promuovere effetti teratogeni, per lo più la comparsa di edema pericardico ed alterazioni cardiovascolari. In breve, gli embrioni sono stati trattati con berberina (50 e/o 100 mg/L), disciolta in Hank’s buffer, a partire da 24 hpf (senza essere decorionati), fino ad un massimo di 96 h di esposizione. I controlli sono stati invece trattati solo in presenza di Hank’s buffer. È noto che l’edema pericardico è spesso associato ad alterazioni dello sviluppo e della funzionalità del cuore e dei vasi. Pertanto, abbiamo condotto un’analisi funzionale di vari parametri dell’attività cardiaca a 48 hpf, tra cui frequenza cardiaca, gittata sistolica atriale e ventricolare, gittata cardiaca, indice di contrattilità ventricolare ed atriale, ed il rapporto tra la frequenza atriale e ventricolare A/V su embrioni a stadio 48 hpf. I dati ottenuti mostrano che il trattamento con berberina (100 mg/L) determina una riduzione significativa della frequenza cardiaca, della gittata cardiaca, della gittata sistolica atriale e dell’indice di contrattilità atriale rispetto ai controlli e non influenza gli altri parametri considerati; tali risultati indicherebbero quindi che il trattamento con berberina durante lo sviluppo embrionale può indurre bradicardia associata a ridotta contrattilità atriale. Successivamente, abbiamo condotto un'analisi istologica (ematossilina-eosina) del cuore su sezioni di embrioni a stadio 120 hpf, da cui è emerso che, rispetto alla morfologia normale, il trattamento con berberina (100 mg/L) promuove un significativo incremento della percentuale di embrioni il cui cuore era caratterizzato da una morfologia allungata e/o dal distacco dell’endocardio dal miocardio atriale, suggerendo che la berberina può alterare la morfogenesi cardiaca. Al fine di investigare l’eventuale coinvolgimento della berberina nello sviluppo e nella funzionalità vascolare abbiamo condotto studi di microangiografia in embrioni a stadio 48 e 72 hpf, microiniettando specifici traccianti (destrano coniugato con la molecola fluorescente Texas Red e/o Evans blue), confermando la presenza di anomale e immature ramificazioni vascolari (branching) rappresentative di un’alterata angiogenesi. Inoltre i risultati della microangiografia mostrano che la berberina non influenza la permeabilità vascolare. Dato che il VEGF-A (fattore di crescita dell’endotelio vascolare-A, solitamente indicato come VEGF) e la Cdh5 (caderina dell’endotelio vascolare) hanno un ruolo importante nello sviluppo e nella funzionalità sia del cuore che dei vasi nei vertebrati, per valutare un loro possibile coinvolgimento negli effetti prodotti dal trattamento con berberina abbiamo studiato l’effetto di questo composto (50 e 100 mg/L) sull’espressione delle due copie del gene vegfa presenti nello zebrafish, vegfaa e vegfab, e su cdh5, mediante la tecnica di RT-qPCR in embrioni a stadio 48 e 72 hpf. I dati ottenuti indicano che il trattamento con berberina 100 mg/L promuove in modo significativo l'incremento dell'espressione di vegfaa unicamente a 72 hpf mentre l'espressione di vegfab e cdh5 non varia in nessuna condizione. Nel complesso i nostri risultati indicano che il trattamento con berberina durante lo sviluppo embrionale causa importanti alterazioni funzionali e morfologiche sia nel cuore che nei vasi, e che la regolazione del Vegfa a può avere un ruolo in questi effetti.