• stress ossidativo
• SLA
• neurodegenerazione

RIASSUNTO
La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa caratterizzata da una progressiva e selettiva perdita dei motoneuroni a livello della corteccia motoria primaria, del tronco cerebrale e del midollo spinale. L’eziologia e la patogenesi della forma sporadica di SLA (SLAs) sono ancora in gran parte da chiarire. La SLAs viene considerata una malattia degenerativa multifattoriale, nella quale la morte cellulare sembra essere conseguenza della complessa interazione tra fattori di suscettibilità genetica e fattori ambientali. Per spiegare la morte neuronale sono state proposte diverse ipotesi, tra le quali le più accreditate chiamano in causa l’eccitotossicità glutammatergica, le alterazioni mitocondriali e lo stress ossidativo (Rothstein et al., 2009). Quest’ultimo sembra essere coinvolto nei meccanismi di neurodegenerazione che si manifestano nella SLAs, ma resta comunque da chiarire se lo stress ossidativo sia una causa della degenerazione neuronale o ne sia una conseguenza diretta.
Durante la respirazione aerobica, il metabolismo cellulare e la difesa contro agenti patogeni vengono prodotte specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto (ROS e RNS); a concentrazioni fisiologiche, ROS e RNS giocano un’importante funzione come mediatori e regolatori cellulari, ma ad elevati livelli portano inizialmente ad alterazioni nell’equilibrio redox cellulare e, in fine, allo sviluppo della condizione nota come stress ossidativo (Niedzielska et al., 2015). L’organismo umano, al fine di neutralizzare tali sostanze tossiche, ha sviluppato una pletora di meccanismi di difesa (Lee et al., 2005; Sykiotis e Bohmann, 2010). Tra questi, la via mediata dal fattore di trascrizione Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nfe2l2), noto anche come Nfr2, è attualmente riconosciuta come uno dei principali pathway di difesa cellulare contro lo stress indotto sia da sostanze pro-ossidanti che xenobiotiche (Friling et al., 1990; Li et al., 1992; Rushmore et al., 1991). Nrf2, tramite il legame ad una sequenza nucleotidica chiamata Antioxidant Response Element (ARE), modula l’attivazione trascrizionale dei suoi geni bersaglio (Rushmore et al., 1991); tra questi sono presenti geni che codificano per enzimi antiossidanti e per enzimi di detossificazione di fase II (Kundu e Surh, 2008). Il coinvolgimento di Nrf2 nell’espressione, sia basale che inducibile, dei geni ARE-dipendenti lo rende il principale regolatore della risposta antiossidante e un modulatore di numerosi processi, quali la risposta immunitaria ed infiammatoria, il rimodellamento tissutale e la proliferazione cellulare (Hyberston et al., 2011). Sono stati identificati, nella regione del promotore di NRF2, tre polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), -653A>G -651G>A e -617C>A, in grado di modulare l’espressione e la funzione del gene stesso (Marzec et al., 2007). Diverse evidenze in letteratura hanno dimostrato l’implicazione di Nrf2 in molti meccanismi patogenetici coinvolti nella
neurodegenerazione (Johnson et al., 2010; Pareek et al., 2011; Stack et al., 2010; Kim et al., 2013; Lou et al., 2014; Sarlette A. et al, 2008; Tanji et al., 2013; Bergstrom et al. 2014; Vargas M.R. et al., 2008). In particolare, è stata riportata un’associazione fra l’aplotipo GAGCAAAA, contenente i tre alleli comuni in corrispondenza dei siti polimorfici -653A>G, -651G>A e -651C>A, ed un ritardo di 4.6 anni nell’insorgenza della Malattia di Parkinson (PD), sia in una popolazione svedese che in una polacca (Von Otter M. et al., 2010); successivamente, la variante allelica -653G è stata associata con un aumento del rischio di sviluppare PD in un’estesa coorte di pazienti italiani, maltesi e tedeschi (Von Otter et al., 2014). Inoltre, Bergstrom e collaboratori hanno osservato l’associazione fra l’aplotipo GAGCAGA e un ritardo di 4 anni nell’età di insorgenza della SLA (Bergstrom et al., 2014).
In base a tali presupposti, lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare una possibile associazione tra i polimorfismi -653 A>G, -651 G>A e -617 C>A, presenti nel promotore del gene NRF2, e il rischio di insorgenza di SLA e la loro possibile implicazione nei meccanismi molecolari che sono alla base della risposta cellulare allo stress ossidativo. A tal fine abbiamo valutato:
• la distribuzione delle frequenze alleliche e genotipiche dei tre polimorfismi funzionali -653 A>G, -651 G>A e -617 C>A in 140 pazienti SLAs e 134 controlli sani; la genotipizzazione è stata condotta mediante sequenziamento automatico diretto della regione di DNA di interesse.
• i livelli plasmatici di alcuni biomarcatori di stress ossidativo, determinati tramite metodi spettrofotometrici; in particolare, come marker di danno ossidativo, sono stati dosati i Prodotti di Ossidazione Avanzata alle Proteine (AOPP) e, come markers antiossidanti non enzimatici, la Capacità Antiossidante Ferro Riducente (FRAP) e i gruppi tiolici totali plasmatici. Inoltre, come markers antiossidanti enzimatici, sono stati valutati, in 28 pazienti SLAs e in 10 controlli sani, l’attività totale dell’enzima Superossido Dismutasi (Sod) e della Catalasi (Cat).
• la possibile influenza delle varianti alleliche rare -653G, -651A e -617A sui livelli plasmatici dei marcatori di stress ossidativo, sia nella popolazione totale che nelle popolazioni di pazienti e controlli separatamente, suddividendo i soggetti in base al genotipo per ogni polimorfismo oggetto di studio.
• L’eventuale associazione dei polimorfismi funzionali presenti nel promotore con le caratteristiche cliniche dei pazienti, in particolare forma clinica (bulbare o spinale), durata media di malattia, età di esordio e punteggio dell’“ALS Functional Rating Scale” (ALSFRS).
L’analisi dei dati relativi allo SNP -653A>G mostra associazione tra la variante allelica rara -653G e un aumento del rischio di malattia (OR 0.95 IC95% 0.58-1.57); relativamente ai polimorfismi -651 G>A e -617 C>A non abbiamo riscontrato differenze significative nella distribuzione genotipica e nelle frequenze alleliche dei pazienti con SLAs rispetto ai relativi controlli.
In relazione all’eventuale associazione dei polimorfismi studiati con le caratteristiche cliniche dei pazienti i risultati ottenuti mostrano che lo SNP -653A>G non influenza né la forma clinica (bulbare o spinale) né il punteggio dell’ALSFRS; nonostante non siano state evidenziate differenze significative della durata di malattia tra i gruppi genotipici, si nota comunque una riduzione di tale parametro (rispettivamente di 11 e 18 mesi) nei portatori dei genotipi -653AG e -653GG rispetto ai pazienti con genotipo -653AA.
Dall’analisi dei dati relativi allo stress ossidativo emerge che i livelli plasmatici degli AOPP risultano essere più elevati nei pazienti SLAs rispetto ai controlli (p<0.001), mentre i livelli dei tioli sono ridotti nei primi rispetto ai secondi (p<0.001). In relazione agli enzimi antiossidanti è stata osservata un’elevata attività della SOD nei pazienti rispetto ai controlli (p<0.001). Per quanto riguarda la FRAP e la catalasi non sono state riscontrate differenze tra i due gruppi di studio.
Suddividendo i soggetti della nostra popolazione di studio nei portatori dei tre genotipi generati dal polimorfismo -653G>A i nostri risultati mostrano un aumento significativo dei livelli plasmatici degli AOPP e della FRAP nei portatori del genotipo -653AG rispetto ai soggetti -653AA sia nella popolazione totale che nel gruppo dei pazienti, mentre non si riscontrano differenze in quello dei controlli. Al contrario, i livelli plasmatici dei gruppi tiolici totali risultano ridotti nei soggetti -653AG rispetto a quelli -653AA, nella popolazione totale; un trend di riduzione con andamento simile è stato riscontrato solo nei pazienti, seppure non venga raggiunta la significatività. Non sono emerse differenze significative tra i livelli dei biomarcatori misurati nei portatori dei genotipi derivanti dagli SNPs -651G>A e -617C>A.
I risultati, inoltre, mostrano un aumento significativo dell’attività della SOD nei soggetti -617CA rispetto ai -617CC e nei soggetti -651GG rispetto ai -651GA, lo stesso trend si osserva per la CAT. Non si osservano variazioni nell’attività dei due enzimi in relazione ai genotipi generati dal polimorfismo -653A>G.
In conclusione, i dati ottenuti nel presente lavoro di tesi indicano la variante allelica -653G è associata ad un aumento del rischio di malattia. Inoltre, si osserva la presenza di un alterato equilibrio redox nei pazienti SLAs così come un legame tra il genotipo -653AG e la condizione di stress ossidativo. In base ai risultati ottenuti possiamo ipotizzare che la presenza dell’allele -653G conduca ad un deficit di espressione della proteina Nrf2 con alterazione del pathway Nrf2-ARE e conseguente attenuazione della risposta antiossidante cellulare. Ciò può indurre un accumulo di ROS che risulta deleterio soprattutto a livello neuronale, data l’elevata sensibilità del SNC. Diversi studi in letteratura hanno dimostrato come la sovraespressione indotta di Nrf2 conferisca neuroprotezione attraverso un incremento della produzione di enzimi antiossidanti indispensabili per la difesa contro lo stress ossidativo cerebrale (Vargas et al., 2008; Stack et al., 2010; Lou et al., 2014; Yang et al., 2014). Possiamo quindi ipotizzare che molecole induttrici di Nrf2 potrebbero essere utilizzate come trattamento per migliorare le difese cellulari in risposta a stress ossidativo ed infiammatorio anche nei pazienti affetti di SLA.