• CRISPR
• genome editing
• LGALS3
• Cas9

Il sistema CRISPR/Cas9 di tipo II, identificato per la prima volta in Streptococcus pyogenes, ha suscitato un enorme interesse nella comunità scientifica in quanto permette di introdurre tagli a doppio filamento (DSB) su una sequenza di DNA di interesse. Evolutosi nei Procarioti, come sistema immunitario a carattere adattivo, il sistema è composto principalmente da una ribonucleoproteina, costituita dalla nucleasi Cas9 e da un RNA guida di 20 nucleotidi (sgRNA), che è in grado di identificare una sequenza trinucleotidica PAM (Protospacer Adjacent Motifs) altamente presente nel genoma (5’-NGG-3’). Questa sequenza viene riconosciuta solo se è preceduta da una sequenza complementare al sgRNA e, in caso di riconoscimento, viene realizzato il DSB. Il taglio creato verrà riparato dalla cellula tramite il meccanismo di ricombinazione omologa (HDR) che riparerà il DSB senza inserire mutazioni e usando come stampo una sequenza specifica di DNA, oppure tramite il meccanismo di riparazione non omologa (NHEJ) che porterà all’introduzione di mutazioni indel nella sequenza.
La seguente tesi ha lo scopo di individuare il miglior metodo di trasfezione per effettuare il “gene editing” con la tecnologia CRISPR/Cas9 su linee cellulari immortalizzate, e di portare alla creazione di linee isogeniche che differiranno soltanto per un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP), rs4644, del gene LGALS3.
Nello specifico sono state utilizzate tre tecniche di trasfezione.
La prima tecnica prevede l’utilizzo della Lipofectamine 3000 per trasfettare il plasmide SpCas9D10A, esprimente il gene Cas9 ligato ad una sgRNA predetta in silico, nelle cellule immortalizzate. Una volta avvenuta la trasfezione, il plasmide produrrà un singolo taglio a livello dell’allele C del polimorfismo di nostro interesse e questo taglio verrà riparato grazie ad una sequenza a singolo filamento (ssODN) che ha l’allele A e delle sequenze fiancheggianti, omologhe al sito target, di 40 bp.
La seconda tecnica utilizzata prevede una co-trasfezione del plasmide SpCas9D10A e del vettore donor HR410PA-1, sempre con l’uso dell’agente Lipofectamine 3000. Il vettore donor HR410PA-1 è munito di marcatore cellulare EGFP-Puromicina fiancheggiato da siti LoxP ed è stato costruito tramite un doppio clonaggio sia di una porzione dell’introne del gene LGALS3 e sia della porzione dell’esone, a genotipo noto A/A nel caso dello SNP di nostro interesse, dello stesso gene.
La terza tecnica si basa sull’utilizzo di vettori lentivirali come “agenti” di trasfezione sia per il plasmide pCW-Cas9, che ha il gene della Cas9 inducibile dalla doxiciclina e un gene di resistenza alla puromicina, sia per il vettore pLX-sgRNA che porta l’sgRNA target e un gene di resistenza alla blasticidina.
Dai risultati ottenuti è emerso che la tecnica di trasfezione che prevede l’impiego del plasmide HR (presenta un marcatore di selezione che sarà presente soltanto nelle cellule che hanno subito la ricombinazione omologa), e quella che utilizza i vettori lentivirali (viene ridotto al minimo il problema della efficienza di trasfezione e della selezione delle cellule trasfettate), hanno permesso di individuare e creare linee isogeniche.