• polymorphisms
• polimorfismi
• pancreatic cancer
• microRNA
• microRNA
• fattori prognostici
• fattori predittivi
• predictive factors
• EGFR
• carcinoma del pancreas
• prognostic factors

Il carcinoma pancreatico rappresenta la quarta causa di morte per neoplasia nei paesi occidentali con oltre 200.000 nuovi casi e decessi all’anno nel mondo e oltre 7.000 in Italia ogni anno.
Circa l’80% dei casi alla diagnosi si presenta in stadio localmente avanzato o metastatico, non suscettibile di trattamenti locali con intento curativo; per questi pazienti il trattamento medico rappresenta la principale opzione terapeutica.
Anche per i pazienti che si presentano alla diagnosi con una malattia resecabile, il trattamento medico rappresenta un’importante arma terapeutica in quanto una chemioterapia adiuvante postoperatoria permette un prolungamento significativo della sopravvivenza libera da ripresa di malattia e globale.
Il trattamento chemioterapico ha dimostrato di poter migliorare la sopravvivenza dei pazienti con carcinoma pancreatico in stadio avanzato rispetto alla migliore terapia di supporto; in particolare, un trattamento con l’analogo nucleotidico pirimidinico gemcitabina ha rappresentato a partire dalla fine degli anni ’90 il trattamento standard in questa malattia permettendo una sopravvivenza superiore rispetto alla terapia con 5-fluorouracile e alla sola terapia di supporto. Purtroppo, però, il trattamento con gemcitabina permette di ottenere una risposta obiettiva di malattia in solo il 10% dei pazienti circa e una sopravvivenza mediana di solo 6 mesi. La gemcitabina è risultata efficace anche in fase adiuvante ottenendo un raddoppiamento della percentuale di pazienti liberi da malattia e vivi a 5 anni dall’intervento chirurgico rispetto alla sola chirurgia. Purtroppo, però, anche in questo setting, la percentuale di pazienti che beneficia del trattamento è molto limitata e solo il 20% dei pazienti rimane libero da progressione della malattia a lungo termine.
Molte strategie sono state sperimentate per cercare di migliorare i risultati del trattamento del carcinoma pancreatico; un primo tentativo è stato quello di ottimizzare l’uso della gemcitabina modificandone dosi e tempi di infusione; in particolare, il prolungamento dell’intervallo di infusione del farmaco potrebbe permettere una maggiore attivazione dello stesso a livello intracellulare e quindi una maggiore attività. Altra possibilità molto studiata è stata quella di utilizzare combinazioni di altri chemioterapici in associazione alla gemcitabina; in particolare a questo riguardo i farmaci risultati più attivi sono stati i derivati del platino (cisplatino ed oxaliplatino) e le fluoropirimidine (5-fluorouracile e capecitabina).
Sono stati studiati anche regimi di combinazione polichemioterapici a 3 o 4 farmaci contenenti gemcitabina (es. PEFG, PEXG, PDXG) e anche senza gemcitabina (es. FOLFIRINOX).
Ulteriore strada percorsa dalla ricerca oncologica degli ultimi anni è stata quella di associare alla chemioterapia farmaci diretti contro specifici bersagli molecolari potenzialmente implicati nella progressione della malattia; nonostante i molti farmaci studiati, solo un inibitore dell’attività tirosin-chinasica del recettore per l’Epidermal Growth Factor (EGFR), l’erlotinib, ha dimostrato di poter prolungare la sopravvivenza dei pazienti rispetto al solo trattamento chemioterapico con gemcitabina.
Nonostante i molti sforzi, purtroppo, però, ancora oggi il trattamento medico del carcinoma pancreatico permette di ottenere risultati limitati, con regressioni della malattia in una minoranza dei pazienti e sopravvivenza mediana dei pazienti inferiore a 1 anno. Inoltre tutti i trattamenti disponibili comportano effetti collaterali che possono inficiare ulteriormente i risultati della terapia.
In considerazione di tutto questo e vista l’attuale disponibilità di più farmaci, appare importante cercare degli strumenti che possano permettere una migliore selezione del trattamento nel singolo paziente in modo da aumentare le probabilità di risposta al trattamento e ridurre il rischio di effetti collaterali non necessari.
La variabilità genetica individuale in geni chiave coinvolti nell’azione del singolo farmaco (presente come mutazioni somatiche o polimorfismi genici) potrebbe giustificare le differenze individuali nella risposta e nella tossicità dei trattamenti medici.
Anche per i farmaci utilizzati nel trattamento del carcinoma del pancreas avanzato (gemcitabina, derivati del platino, fluoropirimidine, erlotinib) è stato dimostrato come alterazioni di alcuni geni presenti con notevole frequenza nella popolazione generale possano condizionare la sensibilità o la resistenza al trattamento.
Ad esempio, polimorfismi o variabile espressione nei geni che codificano per enzimi coinvolti nel metabolismo o nel meccanismo d’azione della gemcitabina (CDA, DCK, RRM1, hENT1, ecc.) e dei derivati del platino (ERCC1, XPD, ecc.) possono risultare fattori predittivi di attività e/o efficacia del trattamento.
Un campo di notevole interesse recente in questo ambito è quello dell’espressione dei microRNA, piccole molecole di RNA che hanno dimostrato un ruolo cruciale nella modulazione post-trascrizionale dell’RNA messaggero potendo agire sulla proliferazione e differenziazione cellulare, sull’apoptosi e sulla risposta cellulare ai chemioterapici.
L’obiettivo di questa ricerca è stato quello di studiare fattori predittivi di attività ed efficacia nel trattamento medico del carcinoma del pancreas avanzato mediante l’utilizzo di nuove tecnologie puntando alla personalizzazione del trattamento.
Sono stati studiati i polimorfismi dei geni candidati (ERCC1, XRCC1, XPD, RRM1 e CDA) e i livelli di espressione di proteine (EGFR) e microRNA in 187 pazienti affetti da carcinoma del pancreas avanzato trattati con chemioterapia con gemcitabina (65) oppure con associazioni di farmaci contenenti derivati del platino (122) e in 100 pazienti radicalmente resecati trattati con gemcitabina adiuvante.
I fattori studiati cono stati correlati con la sopravvivenza globale dei pazienti, l’intervallo libero da progressione o recidiva di malattia, l’attività e la tossicità del trattamento.
Sono stati inclusi nello studio i pazienti affetti da carcinoma del pancreas in stadio avanzato o radicalmente resecati trattati con terapia medica presso il Polo Oncologico dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana. Sono stati raccolti e analizzati per gli studi di polimorfismi anche prelievi ematici ottenuti da pazienti metastatici trattati presso le U.O. di Oncologia Medica dell’Ospedale San Raffaele di Milano e di Carrara. I pazienti sono stati trattati secondo l’indicazione oncologica prevista per il caso clinico. I dati clinici necessari riguardanti la malattia, la risposta al trattamento e la sopravvivenza sono stati registrati per le successive analisi.
Sono stati inoltre prelevati e conservati adeguatamente campioni ematici di sangue venoso periferico dei pazienti per le analisi genetiche individuali e sono stati richiesti campioni di materiale tumorale paraffinato già ottenuto a scopo diagnostico e conservato presso le U.O. di Anatomia Patologica per le analisi di espressione a livello tumorale. Prima delle analisi i campioni sono stati associati ai rispettivi dati clinici mediante un codice alfanumerico e quindi i dati sono stati resi anonimi.
Le tecnologie utilizzate per l’analisi dei fattori biomolecolari sono state:
- la microdissezione laser per selezionare cellule tumorali e cellule dell’epitelio duttale normale dai campioni tumorali conservati;
- estrazione del DNA e dell’RNA dal sangue periferico dei pazienti e dai campioni tumorali paraffinati precedentemente trattati con microdissezione laser;
- retro-trascrizione del RNA;
- amplificazione del DNA e del cDNA mediante PCR;
- analisi dei polimorfismi mediante PCR quantitativa;
- analisi dei microRNA mediante tecniche di microarray;
- analisi dell’espressione proteica a livello tumorale mediante tecniche di immunoistochimica con specifici anticorpi.
I risultati ottenuti sono stati analizzati utilizzando il test t di Student, il test χ2 di Pearson e il test di Wilcoxon; le curve di sopravvivenza sono state costruite secondo il metodo di Kaplan-Meier; i dati di sopravvivenza sono stati confrontati mediante il log-rank test; sono state condotte analisi multivariate dei dati secondo il modello a rischio proporzionale di Cox. Le analisi statistiche sono state eseguite mediante il software SPSS.
L’espressione di EGFR sui 100 pazienti operati e trattati con chemioterapia adiuvante è risultata correlata al grado di differenziazione tumorale ma non ha dimostrato un impatto significativo prognostico o predittivo di per se.
L’espressione di miR-21 invece è risultata un fattore prognostico/predittivo di peggiore sopravvivenza sia in pazienti con adenocarcinoma del pancreas avanzato che in pazienti resecati trattati con gemcitabina ed è inoltre stato implicato nei meccanismi di resistenza a questo chemioterapico.
Inoltre analizzando l’espressione di oltre 1200 microRNA, abbiamo identificato miR-211 come uno dei principali fattori prognostici/predittivi in pazienti resecati e trattati con gemcitabina adiuvante.
Dall’analisi di polimorfismi, abbiamo verificato il ruolo di polimorfismi di geni di riparazione del DNA come fattore predittivo di efficacia della chemioterapia con derivati del platino; infatti, i polimorfismi di XPD (Lys751Gln e Asp312Asn), ERCC1 (C118T) e XRCC1 (Arg399Gln) hanno dimostrato una correlazione con la sopravvivenza di pazienti metastatici trattati con derivati del platino ma non di pazienti nello steso stadio di malattia trattati con sola gemcitabina.
In conclusione, gli studi di questo progetto di tesi hanno permesso di dimostrato nuovi fattori prognostici e predittivi in pazienti con carcinoma del pancreas. Questi fattori andranno validati prospetticamente in studi clinici e potranno rappresentare in futuro le basi per un trattamento personalizzato anche per i pazienti con tumore del pancreas. Inoltre, l’analisi funzionale dei microRNA implicati come fattore prognostico e di resistenza ai farmaci, potranno permettere di identificare nuovi bersagli molecolari importanti per il trattamento di questa difficile malattia e per il superamento della resistenza ai chemioterapici.

Pancreatic cancer is one of the leading cause of cancer-related death. The majority of patients has locally advanced or metastatic disease at diagnosis; for these patients, chemotherapy demonstrated the possibility to prolong survival and palliate symptoms. The most active drugs in this disease are gemcitabine, platinum derivates and fluoropyrimidines. Gemcitabine and fluoropyrimidines demonstrated prolonged survival even as adjuvant treatment after surgical resection of pancreatic tumor in patients with localized disease.

However, the results of chemotherapeutic treatment are still suboptimal with a median overall survival of less than 1 year in the metastatic setting and less than 40% of patients responding to chemotherapy; even patients who underwent surgical resection show high risk of disease recurrence with a 5-year overall survival rate of about 20%.

Therefore, the identification of prognostic and predictive factors seems to be crucial for maximizing therapeutic efficacy and minimizing useless treatment in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In this study we evaluate the prognostic and predictive role of microRNA expression, candidate gene polymorphisms (CDA, RRM1, ERCC1, XRCC1, XPD) and EGFR expression in 100 patients resected for pancreatic adenocarcinoma and treated with adjuvant gemcitabine, 65 patients treated with first-line gemcitabine for advanced disease and 122 patients treated with combination chemotherapy for advanced disease.

The expression of miR-21 resulted a major prognostic/predictive factors of shorter survival in patients treated with gemcitabine both in adjuvant and in metastatic setting and it could be implicated in resistance to gemcitabine by activating intracellular pathways of proliferation in cancer cells. Even the expression of miR-211 resulted a significant prognostic factor in the adjuvant group and its functional role is under investigation. Single-nucleotide polymorphisms of DNA reparation genes (ERCC1 C118T, XPD Lys751Gln, XPD Asp312Asn, XRCC1 Arg399Gln) resulted significant predictors of survival in metastatic patients treated with platinum derivates but not in patients receiving only gemcitabine.

These results, if validated in prospective study in the future, may help the selection of specific treatment for individual patients leading to the personalization of care in pancreatic adenocarcinoma.