• ciliopatie
• discinesia ciliare primaria
• TALEN

Le ciglia sono microscopiche estroflessioni cellulari vitali per la sopravvivenza e la riproduzione di molti protisti ed eucarioti. Il battito regolare di questi organelli evolutivamente conservati esercita una forza meccanica responsabile della motilità di piccoli organismi e della circolazione dei fluidi attraverso le superfici epiteliali negli animali pluricellulari complessi. Dato che le ciglia mobili sono essenziali per la fisiologia dell'organismo, il loro malfunzionamento causa una serie di disordini nell'uomo chiamati collettivamente ciliopatie, tra queste la più frequente è la discinesia ciliare primaria (DCP). La DCP è una malattia genetica autosomica recessiva caratterizzata da difetti nella motilità delle ciglia che rivestono gli epiteli di vari organi. Il battito sincronizzato delle ciglia determina lo spostamento del muco che riveste i tratti respiratori, fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi dell'organo, una scarsa motilità ciliare si riflette in una compromissione del meccanismo di clearance mucociliare determinando una serie di sintomi quali infezioni croniche dei tratti respiratori superiori ed inferiori, asma, idrocefalia, e randomizzazione degli organi interni (situs inversus) che si verifica nel 50% dei casi e prende il nome di Sindrome di Kartagener. La DCP è causata da una serie di geni che codificano per proteine dell'assonema ciliare, circa il 90% dei casi di DCP sono causati da mutazioni nei geni codificanti per le dineine, proteine motrici necessarie per l'assemblaggio e la motilità delle ciglia. Uno di questi è il gene DNAH11, localizzato sul cromosoma 7 e codificante la catena pesante della dineina. Mutazioni tronche o missenso a carico di questo gene sono state identificate in diversi pazienti che presentavano randomizzazione degli organi interni e compromissione dell'apparato respiratorio. In questi pazienti, nonostante l’analisi al microscopio elettronico abbia dimostrato una ultrastruttura normale degli assonemi ciliari, l’analisi videomicroscopica ha invece rivelato un battito ciliare ipercinetico responsabile del fenotipo DCP.
Questo lavoro di tesi è incentrato sulla messa a punto di un nuovo sistema di terapia genica per la correzione della sequenza mutata, tramite ricombinazione sito-specifica, del gene DNAH11 e il recupero del fenotipo normale delle cellule ciliate in pazienti affetti da DCP, portando ad una riduzione delle infezioni respiratorie alla base della compromissione broncopolmonare.
In collaborazione con il team del Dott. Massimo Pifferi, responsabile della Sezione di Pneumologia ed Allergologia del Dipartimento di Pediatria dell'Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana, sono state riconosciute ed identificate una serie di mutazioni in diversi esoni di DNAH11 in pazienti affetti da DCP. Il lavoro di tesi è incentrato sul riparazione del difetto genetico ritrovato nell'esone 41, presente in vari pazienti e causa della produzione di una proteina tronca.
La ricombinazione sito-specifica viene realizzata utilizzando fattori dell'attivazione trascrizionale (TALE), normalmente espressi in molte specie di Xanthomonas e la cui funzione fisiologica favorisce l'infezione nella cellula ospite modulando la sua espressione genica. Attraverso opportune modifiche, è possibile produrre dei sistemi TALE-Nuclease (TALEN) che riconoscono le sequenze bersaglio sulle quali intendiamo intervenire per correggere un difetto genetico sostituendo, per esempio, la sequenza mutata con quella presente nel gene funzionale. La costruzione del TALEN è avvenuta tramite amplificazione PCR di quattro tipi di monomeri (ciascuno dei quali lega specificamente una sola base della sequenza bersaglio) utilizzando 18 coppie di primers diverse. I monomeri sono stati assemblati in tre gruppi di esameri ordinati secondo la sequenza di basi della regione bersaglio e successivamente sono stati ligati insieme per il clonaggio all'interno di un plasmide contenente la nucleasi FokI. Poiché FokI funziona solo come dimero, è stato essenziale progettare due TALEN che si leghino a cavallo del sito target. I plasmidi così ottenuti sono stati trasfettati all'interno di cellule 293T contestualmente ad un altro plasmide esprimente la GFP e avente al suo interno le due sequenze specifiche di DNAH11 riconosciute dalle TALEN prodotte. In questo modo è stata verificata la corretta progettazione e il corretto funzionamento del sistema TALEN in vitro. Considerando gli sviluppi futuri del sistema, quindi la sua applicazione in vivo, si è reso necessario apportare alcune modifiche al sistema TALEN per aumentarne l'efficienza grazie ad una collaborazione esterna con i laboratori di Cambridge (Inghilterra) di cui però non potranno essere descritti e discussi i particolari in quanto oggetto di copertura brevettuale.