• Cellule Staminali Mesenchimali
• Cellule Staminali Adulte
• Otx1

Le Cellule Staminali Mesenchimali (Mesenchymal Stem Cells – MSCs) sono cellule pluripotenti capaci di differenziare in elementi maturi di lineages mesodermici, quali osteociti, adipociti e condrociti. Le MSCs risiedono principalmente nel midollo osseo, dove sono state isolate per la prima volta, ma possono trovarsi in quasi tutti i tessuti adulti. La loro capacità di secernere molecole trofiche e immunoregolatorie e la loro possibilità di espansione e differenziazione ex vivo, hanno generato forte interesse per le MSCs quali potenziali strumenti terapeutici nella medicina rigenerativa e nell’ingegneria tissutale. Tuttavia, per l’applicazione clinica delle MSCs, è necessario comprendere a fondo i meccanismi molecolari che ne regolano il self-renewal e la differenziazione nei diversi lineages. Nel laboratorio dove ho svolto il mio lavoro di tesi, è stato ipotizzato un ruolo chiave nella regolazione delle MSCs da parte degli omeogeni, così chiamati in quanto contengono una sequenza altamente conservata di 183 nucleotidi, l’omeobox, che codifica l’omeodominio. Quest’ultimo presenta struttura helix-turn-helix, che permette il legame al DNA e che quindi consente di classificare le omeoproteine come fattori di trascrizione. L’omeogene Otx1, appartenente alla sotto-famiglia degli omeogeni Otx, caratterizzati da un dominio bicoid, è omologo nei Vertebrati del gene Orthodenticle di Drosophila e gioca un ruolo fondamentale nella morfogenesi del sistema nervoso e nello sviluppo degli organi di senso. Studi effettuati precedentemente nel nostro laboratorio hanno dimostrato che Otx1, durante la vita adulta, è coinvolto nella regolazione delle cellule staminali ematopoietiche (Hematopoietic Stem Cells – HSCs) e contribuisce alla produzione dei precursori della linea eritroide. Nella regolazione dell’attività delle HSCs, è sempre più evidente il ruolo chiave della nicchia, composta da cellule differenziate di alcuni lineages mesenchimali, in particolare gli osteoblasti, e dalle MSCs. Poiché abbiamo rilevato che l’inattivazione in vivo di Otx1 provoca una notevole fragilità ossea, è verosimile ipotizzare che l’omeogene possa essere coinvolto anche nella regolazione delle MSCs, in particolare nella loro differenziazione osteogenica. A tal proposito, sono stati precedentemente condotti studi di espressione a livello sia trascrizionale che proteico in MSCs primarie murine ed in pre-osteoblasti della linea cellulare MC3T3-E1, una linea clonale osteogenica non tumorale generata a partire dalle ossa della base cranica del topo. Essa rappresenta la finestra temporale idonea per studiare i fenomeni che stanno alla base dell’osteogenesi, dallo stadio di pre-osteoblasti, fino alla differenziazione terminale. Tali studi hanno mostrato un aumento di espressione sia dell’mRNA sia della proteina di Otx1 nel corso del processo differenziativo, che riproduce fedelmente il pattern di espressione di Runx2, master gene dell’osteogenesi. Inoltre, è stato dimostrato che l’espressione di Runx2 e di ALP, ecto-enzima che catalizza la produzione dell’idrossiapatite di calcio, il mineralizzante della matrice ossea, è fortemente ridotta durante la differenziazione osteogenica di MSCs Otx1-/-. Il mio lavoro di tesi si è focalizzato sullo stu-dio della funzione di Otx1 nella regolazione delle mMSCs, analizzando gli effetti della perdita e del guadagno di funzione del gene. Il confronto di mMSCs wt e Otx1-/- allo stadio indifferenziato ha evidenziato che l’inattivazione dell’omeogene determina: 1) un netto aumento della sopravvivenza/proliferazione delle MSCs, anche a passaggi in coltura in cui le cellule wt smettono di dividersi; 2) una riduzione significativa della senescenza cellulare; 3) un decremento dell’espressione di geni del checkpoint G1 → S, quali p53, p21WAF1, p16INK4a e p19ARF/INK4d. Successivi esperimenti di trasfezione transiente con vettore contenente Otx1 hanno evidenziato effetti diametralmente opposti sull’espressione dei geni del checkpoint G1 → S, suggerendo un’azione diretta o indiretta di Otx1 su questi regolatori del ciclo cellulare. Risultati preliminari ottenuti con Saggi di Immunoprecipitazione della Cromatina sembrano indicare che l’omeoproteina sia capace di legare specificamente una sequenza consensus TAATCT/C sul promotore di p53 nelle mMSCs allo stadio indifferenziato, e su quello di p21 in mMSCs indotte in senso osteogenico per 6 giorni. Questi dati supportano l’ipotesi che Otx1 sia coinvolto nel controllo dell’equilibrio fra proliferazione e senescenza e prospettano un modello dinamico in cui l’omeoproteina cambia i suoi targets d’azione, a seconda dello stadio differenziativo delle cellule in cui viene espresso. Inoltre ho analizzato l’espressione di una serie di geni implicati nell’osteogenesi in mMSCs indifferenziate, in seguito ad inattivazione e sovra-espressione di Otx1, e nelle MC3T3-E1, dopo trasfezione transiente del gene. I risultati hanno mostrato un effetto solo sull’attività trascrizionale di geni delle fasi precoci dell’osteogenesi, a livello delle mMSCs, mentre non influenzano le fasi tardive del processo. Tali risultati, rafforzati anche da dati preliminari di ChIP, suggeriscono che l’azione di Otx1 sia relegata prevalentemente alle fasi del commitment osteogenico. Questa ipotesi è avvalorata anche dall’osservazione che le MSCs Otx1-/- mostrano una capacità osteogenica ridotta, ma una differenziazione adipogenica aumentata rispetto alle cellule wt, sia in assenza che in presenza di induzione. Questo dato, sebbene debba essere confermato da analisi più approfondite, prospetta uno scenario in cui Otx1 può agire da “interruttore molecolare” (molecular switch) che “accende” il destino osteogenico e “spegne” quello adipogenico. In conclusione, Otx1 è coinvolto nel controllo della sopravvivenza/proliferazione e differenziazione delle MSCs e nella vita adulta gioca un ruolo di importante regolatore di cellule staminali e progenitori di diversi tessuti.