• SEC
• sintesi proteica
• sanguisuga
• apprendimento a lungo termine

In questa tesi sperimentale sono stati analizzati i meccanismi molecolari alla base dell’induzione della senstitizzazione a lungo termine (LT), nella sanguisuga Hirudo medicinalis.
H. medicinalis rappresenta un buon modello sperimentale per studiare i vari e complessi aspetti della funzionalità del SN, apprendimento e memoria inclusi, poiché associa alla semplicità anatomica comportamenti complessi organizzati in circuiti neurali semplici.
Utilizzando l’atto comportamentale dell’induzione al nuoto, ovvero l’induzione di un ciclo di nuoto in risposta ad un lieve stimolo elettrico (stimolo test) applicato sulla cute della porzione caudale dell’animale che aveva precedentemente subito la disconnessione microchirurgica del primo ganglio segmentale dal ganglio cefalico e un opportuno protocollo di addestramento è possibile indurre sensitizzazione a lungo termine (LT).
Precedentemente era stato osservato che la somministrazione di cicloesimide, un inibitore della sintesi proteica, bloccava l’instaurarsi di sensitizzazione LT, suggerendo che la formazione ex-novo di proteine nel SN sia un meccanismo fondamentale per il consolidamento delle tracce mnemoniche nell’apprendimento LT. Infatti, l’analisi elettroforetica mediante SDS-PAGE condotta su pellet e surnatante di omogenato di catene gangliari e ganglio caudale isolati da animali addestrati LT e di controllo (che non avevano subito stimolazioni nocicettive ripetute) ha rilevato un diverso profilo proteico negli omogenati di tessuto nervoso ottenuti dagli animali sensitizzati LT rispetto agli animali di controllo.
In questo lavoro di tesi si è cercato di identificare quali tipi di proteine fossero differenzialmente espresse negli animali sottoposti a sensitizzazione LT rispetto agli animali di controllo e se queste proteine avessero un effetto fisiologico.
A questo scopo, dopo aver indotto sensitizzazione LT, sono stati preparati pellet e surnatante sia da animali sensitizzati LT che da animali di controllo e sono stati iniettati in animali naive, precedentemente sottoposti ad una sessione di sensitizzazione a breve termine. In una seconda sessione di sensitizzazione eseguita un’ora dopo l’iniezione, solo gli animali che hanno ricevuto il pellet derivato da animali sensitizzati LT hanno mostrato un potenziamento della risposta allo stimolo test dopo singola stimolazione nocicettiva, simile a quello ottenuto dopo ripetute stimolazioni nocicettive. Analogamente a quanto precedentemente osservato dopo sensitizzazione LT, tale potenziamento perdurava per 24 h e non si verificava se il pellet era stato ottenuto da omogenato di tessuto gangliare di animali sensitizzati LT e iniettati quotidianamente con cicloesimide 10 mM.
Per analizzare se nel pellet, ricavato dall’omogenato di catene nervose di animali sensitizzati LT ci fosse una proteina o un pool di proteine con un peso molecolare specifico direttamente coinvolte nell’apprendimento, il materiale ottenuto da omogenati derivati da catene gangliari di animali sensitizzati LT e di animali di controllo sono stati analizzati tramite cromatografia size-exclusion che permette la separazione delle molecole organiche in base al loro peso molecolare.
L’analisi ha evidenziato spettri di assorbanza delle proteine a 280 nm diversi tra pellet derivati dall’omogenato di animali sensitizzati LT e di animali di controllo.
In seguito alla costruzione di una curva di taratura tramite iniezione nella colonna cromatografica di proteine a peso molecolare noto, sono stati evidenziati, in 4 campioni distinti, picchi di assorbanza corrispondenti a vari pesi molecolari (> 50 kDa a 5.42 min; circa 17.5 kDa a 7.89 min; circa 10.9 kDa a 9.18 min.) presenti esclusivamente nel pellet di animali sensitizzati LT e non in quello dei controlli. Sono state raccolte varie frazioni di 1 ml in un range di 5-12 minuti corrispondenti ai diversi picchi di assorbanza osservati e sono state iniettate in animali naïve precedentemente sottoposti ad una sessione di sensitizzazione. In una seconda sessione di sensitizzazione condotta un’ora dopo l’iniezione, gli animali trattati con la frazione di pellet ottenuto da animali sensitizzati LT corrispondente al peso molecolare di circa 10.9 kDa, hanno mostrato un potenziamento della risposta alla stimolazione nocicettiva analoga a quello osservato durante il processo di sensitizzazione LT, mentre le altre frazioni iniettate non hanno indotto effetto. Questi risultati hanno dunque evidenziato il coinvolgimento di una proteina di 10.9kDa nell’instaurarsi dell’apprendimento a lungo termine e forniscono il substrato per un’analisi proteomica attualmente in corso per identificare tale proteina.