Riassunto analitico
Tra i farmaci antinfiammatori non steroidei si possono trovare composti che producono reazioni avverse per il fegato di vario tipo: da sovradosaggio, da risposte idiosincratiche o da formazione di intermedi reattivi. Questi effetti hanno spesso portato al ritiro dal mercato di farmaci antinfiammatori non steroidei contenenti l’anello tiofenico (i.e. il metapirilene ed il suprofene).
Nella seguente tesi abbiamo studiato il CHF-5407 (CHF), un composto in sviluppo contenente nella sua struttura un gruppo tiofenico. Questo composto ha mostrato un’attività farmacologica analoga a quella del Tiotropio (anch’esso contenente un gruppo tiofenico), un noto farmaco usato nella terapia delle malattie croniche ostruttive del tratto polmonare.
Entrambi questi composti sono potenzialmente suscettibili all’ossidazione da parte del citocromo P450 sul gruppo tiofenico e precisamente sull’atomo di zolfo o su uno dei due doppi legami portando alla formazione rispettivamente di un S-ossido o di un epossido. Questi prodotti di ossidazione sono metaboliti reattivi in grado di reagire con nucleofili ed “in primis” con il glutatione (GSH) ed altri gruppi tiolici.
Al fine di studiare la tossicità del CHF e del Tiotropio, abbiamo effettuato esperimenti nel ratto sia in vivo che in vitro. Sia il CHF che il Tiotropio, a seguito dell’ossidazione del, gruppo tiofenico, potrebbero mostrare vari effetti tra cui: deplezione del GSH, aumento della perossidazione lipidica (TBARS), aumento dell’espressione di geni antiossidanti (i.e. mediante attivazione da parte del fattore di trascrizione Nrf2) epatotossicità e morte cellulare.
Ratti Wistar sono stati trattati i.p. con i suddetti composti a 3 dosi: 12,5, 25, e 40 mg/kg. Sia il CHF che il Tiotropio, seppur in misura minore, depletevano il GSH epatico in maniera dose e tempo dipendente (2, 4, 9. 24 h) evidenziando un minimo valore di GSH (circa il 50% del controllo) dopo 4h dal trattamento.
Negli animali sacrificati a 9 h, venivano analizzati: nel plasma i livelli delle alanina transaminasi (ALT) ed aspartato transaminasi (AST), nell’omogenato i TBARS, nelle frazioni microsomiali l’attività eme ossigenasi (HO-1) e varie attività P450 dipendenti (etossicumarina dimetilasi, aminopirina-N-demetilasi ed anilina idrossilasi) e nei sovranatanti 100000 xg venivano saggiate le attività antiossidanti della DT-diaforasi e della glutatione-S-transferasi (GST), particolarmente regolate dall’attivazione di Nrf2.
Il CHF, ma non il Tiotropio, ha aumentato, rispetto al controllo, i livelli delle attività AST e ALT in modo dose dipendente, indicando un diverso pathway metabolico fra i due composti. Per caratterizzare il ruolo del P450 nella bioattivazione del CHF, i ratti sono stati pretrattati i.p. con l’amino-benzotriazolo (un generale inibitore di P450) un’ora prima del CHF alla dose 12,5 mg/kg. I risultati hanno mostrato una diminuzione delle transaminasi indicando un ruolo del P450 nell’epatotossicità di questo composto. Diversamente, a seguito della somministrazione dei due composti, i dati dei TBARS, delle attività P450 dipendenti, dell’OH-1 e della GST e DT-diaforasi non differivano da quelli relativi ai valori di controllo.
Per approfondire l’epatotossicità del CHF sono stati condotti studi in vitro su colture di epatociti ottenuti da ratti Wistar con metodi standard. Le colture sono state incubate per 48 h usando il modello sandwich con due strati di collagene in modo da permettere il ripristino della morfologia cellulare. Gli epatociti sono stati poi trattati per 24-48 h a dosi 25, 50, 100 e 200 μM di CHF. I dati ottenuti a queste concentrazioni non hanno mostrato né significativi aumenti di lattato deidrogenasi né variazioni delle attività enzimatiche determinate in vivo. Ulteriori studi con dosi maggiori di CHF sono in corso
In conclusione, il CHF a differenza del Tiotropio, è risultato epatotossico suggerendo un diverso metabolismo e produzione dei due possibili intermedi reattivi (S-ossido ed epossido) capaci non solo di depletere GSH ma di reagire con altri cruciali target cellulari tiolici dando luogo a morte cellulare.
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