• tempo di replicazione
• analisi genomica
• asincronismo
• duplicazioni segmentali

La tesi ha per obiettivo lo studio del tempo di replicazione e dell’asincronismo replicativo di una regione cromosomica instabile della banda 7q11.23, caratterizzata dalla presenza di duplicazioni segmentali; queste, dette anche Low Copy Repeats, sono siti hot spot per riarrangiamenti cromosomici, spesso causa di disordini genetici congeniti. La regione considerata è sede di “copy number variations (CNV)” associate alla sindrome di Williams-Beuren. La sindrome è un disordine genetico raro con incidenza di circa uno su 20.000 nati vivi; è caratterizzata da stenosi aortica sopravalvolare, ritardo mentale associato ad un carattere estremamente socievole ed estroverso, invecchiamento precoce e un particolare dismorfismo facciale.
I riarrangiamenti legati alla sindrome sono più frequentemente delezioni da 1,5 a 1,8 Mb, ma anche duplicazioni e inversioni. Si ritiene che le anomalie cromosomiche siano dovute a ricombinazione omologa non allelica tra blocchi di duplicazioni segmentali.
Lo studio replicativo della regione 7q11.23 ha lo scopo di identificare eventuali siti di transizione del tempo di replicazione e di asincronismo replicativo, quali marcatori epigenetici ritenuti potenziali fattori di instabilità genomica. Si propone inoltre di verificare se l’esposizione ad agenti mutageni o cancerogeni possa influenzare tali parametri. E’ stato infatti dimostrato che siti di transizione del tempo di replicazione caratterizzano le duplicazioni segmentali fortemente ricombinogene della regione 22q11. Inoltre siti di transizione risultano associati ad un aumento del danno al DNA; per esempio nelle regioni cromosomiche 11q e 21q presentano mutazioni ricorrenti a carico di oncogeni e geni oncosoppressori. L’elevata suscettibilità al danno al DNA delle regioni di transizione del tempo di replicazione è considerata un effetto della organizzazione della cromatina: essendo questi siti intermedi tra regioni di cromatina attiva a replicazione precoce e regioni silenti tardo replicanti, lo stallo della forca replicativa aperta in questi siti favorirebbe la formazione di rotture a doppio filamento del DNA e conseguenti riarrangiamenti cromosomici. Per le duplicazioni segmentali della regione instabile 22q11 è stato inoltre dimostrato che oltre a contenere siti di transizione del tempo di replicazione sono caratterizzate da asincronismo replicativo e da picchi di flessibilità, caratteristiche rilevanti per la formazione di rotture e riarrangiamenti in altre regioni instabili note come siti fragili. Su questa base è stato ipotizzato che le modificazioni epigenetiche legate alla conformazione della cromatina nelle duplicazioni segmentali possano essere rilevanti per la formazione dei riarrangiamenti.
Il presente studio è stato realizzato su linfociti di sangue periferico ottenuto da soggetti sani, coltivati in vitro sia in condizioni standard che in presenza di trattamenti con agenti noti per la loro attività di interferenza con la replicazione e l’assetto epigenetico della cromatina (afidicolina, UV, bleomicina e azacitidina).
Lo stato replicativo è stato analizzato utilizzando la metodica FISH (ibridazione in situ fluorescente) che permette di visualizzare spot di fluorescenza a loci specifici utilizzando sonde a singolo locus; tali spot possono essere due, indicando la non replicazione della regione di cui la sonda utilizzata è specifica, oppure quattro, indicando una completa replicazione, o infine tre, indicando una replicazione asincrona, cioè su uno solo dei loci allelici. La FISH è stata realizzata utilizzando 20 sonde, individuate attraverso la ricerca sui database dell’ UCSC. che mappano a varie distanze dalle duplicazioni segmentali della banda 7q11.23 in una regione di circa 3 Mb di estensione.