• GSTO

RIASSUNTO


Le glutatione transferasi (GST) sono una superfamiglia di enzimi detossificanti di fase II che, utilizzando il glutatione come cofattore, contribuiscono alla biotrasformazione di numerosi composti di natura esogena ed endogena, come agenti cancerogeni, farmaci e prodotti dello stress ossidativo (Townsend D.M. et Tew K.D., 2003).
La superfamiglia delle GST si suddivide in tre famiglie: citosoliche, mitocondriali e MAPEG (Membrane-Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism) (Ladner J.E. & al., 1999; Robinson A. & al., 2004). La superfamiglia delle GST citosoliche ¨¨ la pi¨´ ampia ed ¨¨ costituita da proteine estremamente polimorfe. Nell¡¯uomo sono state identificate varie classi denominate: ¦Á, ¦Ì, ¦Ð, ¦È, ¦Æ,, ¦Ò; recentemente ¨¨ stata aggiunta una nuova classe denominata omega (GSTO) (Board P.G. & al.,2000).
L¡¯enzima deidroascorbato reduttasi, purificato per la prima volta nel 1994 dal fegato di ratto nel laboratorio in cui ho svolto la presente tesi (Maellaro E. & al.1994), ¨¨ il capostipite di questa nuova classe di glutatione transferasi. Nel 1998, il cDNA di tale enzima ¨¨ stato clonato (Ishikawa T. & al., 1998). Nel 1999 un gruppo americano ha clonato il cDNA di una nuova proteina murina (p28) che veniva sovraespressa in una linea di linfoma radioresistente (Kodym R. & al., 1999). Gli stessi autori hanno inoltre inserito in banca dati la sequenza dell¡¯omologa proteina umana. Successivamente nel 2000 Board et al. hanno raggruppato queste tre proteine in un¡¯unica classe di GST, cui hanno dato il nome di classe Omega (Board P.G. & al.,2000).
Le proteine appartenenti alle GSTO mostrano caratteristiche assai peculiari: sono prive di attivit¨¤ glutatione transferasica, ma sono dotate di numerose altre funzioni di grande importanza nella risposta allo stress cellulare quali l¡¯attivit¨¤ tioltransferasica e deidroascorbato reduttasica, la modulazione del trasporto del calcio, l¡¯attivazione post-traduzionale di altre proteine, la risposta allo shock di natura termica e chimica e l¡¯intervento nel metabolismo dell¡¯arsenico (Board P.G. & al.,2000; Dulhunty A. & al., 2000; Laliberte R.E. & al., 2003; Kodym R. & al., 1998; Zakharyan R.A. & al., 2001). Nell¡¯uomo esistono due forme di GSTO, la GSTO1 e la GSTO2 (Whitbread A.K. & al., 2003). Entrambe sono localizzate sul cromosoma 10, sono costituite da 6 esoni, possiedono nel sito attivo una cisteina in posizione 32 e all¡¯estremit¨¤ terminale una coda di 19 amminoacidi con caratteristiche peculiari di questa classe di GST (Whitbread A.K. & al., 2003).
E¡¯ noto che altre GST e shock protein vengono indotte dal TNF-¦Á e dall¡¯aumento della densit¨¤ cellulare (Mehlen P. & al., 1995; Garrido C. & al., 1997; Morceau F. & al., 2004). Abbiamo quindi deciso di adottare questi modelli sperimentali al fine di studiare i possibili meccanismi di regolazione dell¡¯espressione della GSTO1 e della GSTO2.
Le linee cellulari utilizzate sono state due: una linea cellulare di melanoma umano Me665/2/21 e la linea cellulare U937. Le due linee cellulari differiscono per le modalit¨¤ di crescita: la prima (Me665/2/21) cresce adesa al substrato, mentre la seconda (U937) cresce in sospensione. L¡¯analisi mediante di Immunoblotting su cellule di melanoma umano Me665/2/21 ha dimostrato come, in entrambi i modelli sperimentali, sia possibile osservare un aumento dell¡¯espressione della GSTO. Il siero anti-GSTO1, attualmente in uso, non permette per¨° di distinguere tra le due forme (GSTO1 e GSTO2), perch¨¦ interagisce anche con la GSTO2. Ulteriori indagini, condotte mediante tecniche di RT-PCR hanno permesso di dimostrare che il trattamento con il TNF-¦Á provoca un aumento del solo mRNA della GSTO1, mentre l¡¯aumento della densit¨¤ cellulare induce un aumento del solo mRNA della GSTO2.
E¡¯ noto che molti effetti della stimolazione con TNF-¦Á sono mediati dall¡¯attivazione del fattore nucleare NFkB (Delhalle S., et al. 2004). Tale attivazione ¨¨ stata confermata anche nel nostro modello sperimentale tramite EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Esperimenti condotti mediante Immunoblotting, impiegando il partenolide (inibitore di NFkB (Delhalle S., et al. 2004)), hanno mostrato che l¡¯inibizione dell¡¯attivazione di NFkB blocca anche l¡¯aumento della GSTO (valutato tramite Immunoblotting) indotto dal TNF-¦Á. Questi dati fanno pertanto supporre che il gene per la GSTO1 faccia parte del pattern di geni la cui trascrizione ¨¨ regolata da NFkB.
Per quanto riguarda l¡¯induzione della GSTO2 all¡¯aumentare del grado di densit¨¤ cellulare, tale induzione si osserva nelle cellule di melanoma, ma non nelle U937 che crescono in sospensione. In entrambe le linee cellulari non si osserva attivazione di NFkB all¡¯aumentare della densit¨¤ cellulare. Questi dati fanno supporre che l¡¯induzione della GSTO2 non dipenda dal semplice aumento del numero di cellule, ma da altri fenomeni legati alla confluenza cellulare quali l¡¯adesione al substrato, l¡¯aumento delle giunzioni intercellulari, l¡¯arresto del ciclo cellulare, etc.