• Galectin-3
• LGALS3
• rs4644
• Thyroid carcinoma
• CRISPR-Cas
• gene editing

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated (CRISPR-Cas) è uno dei sistemi immunitari di tipo adattativo utilizzato dai Batteri e dagli Archea per riconoscere e degradare gli elementi genetici estranei (ad esempio i fagi o i plasmidi).
I sistemi CRISPR-Cas sono stati recentemente classificati in tre sottotipi distinti (I, II e III) e il più studiato dalla comunità scientifica è CRISPR-Cas9 di tipo II in termini di efficienza e di applicazione (knock-out, knock-in e knock-down).
CRISPR-Cas9, individuato per la prima volta nello Streptococcus Pyogenes, è un complesso ribonucleoproteico costituito dall’endonucleasi Cas9 e da un singolo RNA guida di circa 20 nt (sgRNA) derivato da CRISPR RNA (crRNA) e CRISPR RNA transattivante (trascrRNA). Per la presenza di un motivo adiacente al protospacer, la cosiddetta sequenza PAM (5’-NGG-3’), lo sgRNA dirige il Cas9 verso il sito di destinazione mediante complementarietà di basi, determinando dei DSB. Le rotture possono essere riparate attraverso due processi: la ricombinazione omologa (HDR) che consente una precisa correzione o sostituzione genica senza l’inserimento di alcuna mutazione, e la ricombinazione non omologa (NHEJ), un meccanismo, invece, soggetto a errori attraverso l’introduzione di mutazioni di tipo indel (inserzione/delezione).
Il mio progetto di tesi fa parte di uno studio che ha lo scopo di valutare l’attività funzionale del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) rs4644 (c.191C>A, p.Pro64His) che si trova nell’esone 3 del gene LGALS3. Studi di associazione caso-controllo hanno mostrato una correlazione tra lo SNP rs4644 e il rischio di sviluppare il cancro. Analisi in silico hanno dimostrato che il cambiamento amminoacidico da Pro a His è altamente dannoso per la cellula (damage rate=1). Inoltre, la proteina codificante, galectina-3, svolge diversi ruoli in base al compartimento cellulare e si ipotizza anche un ruolo nell’attività trascrizionale e nella progressione tumorale.
Per meglio comprendere il ruolo dello SNP abbiamo creato delle linee cellulari isogeniche umane immortalizzate (linea cellulare Nthy-Ori, cellule tiroidee non tumorali) mediante il sistema CRISPR-Cas9 che differiscono dalla linea parentale solo per lo SNP di interesse.
Lo scopo di questa tesi è di valutare il cambiamento, in termini di espressione genica, mediante RNAseq comparando le cellule modificate correttamente con la linea parentale con lo scopo di individuare possibili variazioni geniche attribuibili solo ed unicamente alla modifica da noi introdotta.