• Traslocatore Proteico 18kDa
• Ligandi TSPO
• Residence Time
• Steroidogenesi
• XBD173
• Indice Cinetico

Il Traslocatore proteico 18kDa (TSPO) è una proteina costituita da cinque domini transmembrana, localizzata sulla membrana mitocondriale esterna, in particolare nei punti di contatto tra membrana esterna ed interna del mitocondrio. Nonostante il TSPO sia una proteina ubiquitaria, risulta altamente espresso nei tessuti steroidogenici quali rene, surrene e gonadi a livello periferico, e nella glia a livello centrale. Studi in vivo e in vitro hanno dimostrato che il TSPO fa parte del complesso multiproteico che determina la traslocazione del colesterolo dal citoplasma alla membrana mitocondriale interna (considerato lo stadio limitante la steroidogenesi), dove l’enzima citocromo P450 CYP11A1 lo converte in pregnenolone, il precursore di tutti gli steroidi. A livello centrale tali steroidi prendono il nome di neurosteroidi ed hanno la capacità di modulare l’attività del sistema nervoso. Dato il coinvolgimento di queste molecole endogene in numerose funzioni del SNC e dato che alterazioni dei loro livelli sono state osservate in disordini psichiatrici di diverso tipo tra cui disturbi dell’ansia, depressione e schizofrenia, il TSPO risulta un promettente target farmacologico e i suoi ligandi, quali promotori della neurosteroidogenesi, sono stati proposti come innovativi strumenti terapeutici. Tali molecole, così come le benzodiazepine, mostrano un’azione ansiolitica senza, tuttavia, esercitare i tipici effetti collaterali delle benzodiazepine. I programmi tradizionali di drug discovery basati sull’affinità di legame hanno permesso di ottenere composti altamente affini al TSPO a cui però spesso non corrisponde un’elevata efficacia steroidogenica. Infatti uno dei problemi più ricorrenti riguardo i ligandi del TSPO consiste nella mancanza di correlazione tra affinità di legame ed efficacia steroidogenica. Questo fenomeno ha limitato non solo l’identificazione di composti lead durante i programmi di drug discovery ma ha anche messo in dubbio la specificità degli effetti osservati. Studi recenti hanno mostrato che l’affinità di un farmaco per il suo target non definisce direttamente la sua azione biologica e la sua efficacia, che possono invece essere correlate al tempo che il farmaco spende in contatto con il suo target. Tale parametro è noto come “Residence Time” (RT) e corrisponde al reciproco della costante cinetica di dissociazione (koff). Nel presente lavoro di tesi è stato determinato il valore di RT di alcuni ligandi del TSPO, tra cui composti appartenenti alla classe dei PIGA (composti a struttura fenil-indol-gliossilammidica) e l’XBD173 (chiamato anche Emapunil o AC-5216), un promettente candidato ansiolitico. È stato quindi investigato se il parametro RT è in grado di stimare in maniera più accurata l’efficacia steroidogenica dei ligandi del TSPO rispetto all’affinità di legame. Il valore di RT è stato determinato tramite saggi di binding radioattivo di associazione competitiva su membrane di rene e surrene di ratto utilizzando come probe radioattivo il PK11195 triziato, un ligando classico del TSPO. Successivamente è stata valutata la capacità di tali composti di stimolare la steroidogenesi in un modello di glia (cellule di glioma di ratto, C6) attraverso un saggio immunoenzimatico in termini di produzione di pregnenolone. Infine, per due dei composti testati, PIGA1138 (lungo RT) e PIGA720 (breve RT), in collaborazione con un gruppo di ricerca di farmacologi, è stata valutata l’attività ansiolitica in vivo utilizzando il test Elevated Plus Maze. I dati ottenuti hanno dimostrato che ligandi caratterizzati da un lungo RT sono associati con un’alta efficacia steroidogenica indipendentemente dall’affinità di legame e inoltre presentano un’attività ansiolitica in vivo. Infine per ottimizzare la selezione di ligandi basata sul parametro RT nei processi di drug discovery, è stato messo a punto un metodo di screening più rapido rispetto al laborioso saggio cinetico di associazione competitiva. Questo nuovo approccio richiede due soli tempi di incubazione per testare ogni ligando e sebbene questo metodo non permetta di quantificare esattamente il valore di RT, tramite il parametro noto come “Indice Cinetico” (KI) è possibile predire se un ligando presenta un lungo o breve RT. Nel caso in cui un ligando presenti un lungo RT, questo può successivamente essere determinato con esattezza con il saggio cinetico di associazione competitiva.