• Streptococcus pneumoniae
• polisaccaridi
• zwitterionici
• biocompatibilità
• tetrasaccaride
• test biologici preliminari

I carboidrati sono una classe di composti organici naturali molto diffusa e svolgono importanti funzioni metaboliche e strutturali nei sistemi biologici; sono coinvolti nella comunicazione cellulare, nella duplicazione virale, nell’adesione cellula-cellula, ma anche nello sviluppo di numerose patologie come processi infiammatori, infezioni virali, batteriche e tumori. E’ noto che i polisaccaridi capsulari (CPS) di molti batteri patogeni generano una risposta anticorpale in grado di determinare una protezione specifica. La risposta immunitaria derivante dai vaccini saccaridici nativi (Prevenar 23), ottenuti per lisi delle capsule batteriche, è debole e scarsamente efficiente specialmente nei bambini con età inferiore ai due anni, negli anziani e adulti immunocompromessi. Ciò è dovuto al fatto che i CPS sono in grado di evocare una risposta immunitaria T-indipendente, che non coinvolge i corecettori CD4+ dei linfociti T, responsabili della memoria immunologica. Questo limite è stato in parte superato dalla coniugazione di frammenti dei CPS nativi con proteine immunogeniche ottenendo glicoconiugati in grado di stimolare i linfociti T; ciò ha fornito vaccini che sono introdotti nell’uso clinico per la prevenzione di molteplici patologie infettive causate da patogeni virulenti come: Haemophilus influenzae, Steptococcus pneumoniae (Pneuomovax 7 e 13) e Neisseria meningitidis. Visto che una limitazione all’uso di questi vaccini risiede nella loro micro-eterogeneità strutturale presente nei differenti serotipi della stessa specie, nella presenza di contaminanti biologici e di una possibile ipersensibilità verso la proteina carrier, nell’ultimo decennio, la ricerca si è orientata verso lo sviluppo di metodologie sintetiche volte alla preparazione di strutture poli- o oligosaccaridiche, chimicamente definite e prive di contaminanti biologici, come potenziali vaccini antibatterici.
Studi recenti hanno evidenziato che i CPS di alcuni batteri, tipo Bacteroidis fragilis, caratterizzati dalla presenza di cariche opposte sulle unità ripetitive, possiedono una specifica attività immunostimolatoria T-dipendente correlata alla stimolazione diretta dei recettori TLR2 dei linfociti T e alla operatività di un meccanismo ossidativo NO-mediato a livello del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II. Questi studi hanno reso attuali nuove ricerche mirate allo sviluppo di metodologie chimiche volte a trasformare i più comuni antigeni oligosaccaridici di CPS neutri, o loro frammenti, in saccaridi zwitterionici (ZOS), mantenendo la stessa specificità immunogenica. Fra i CPS neutri quelli che costituiscono la capsula batterica dello Streptococcus Pneumoniae (SP) risultano interessanti per l’alta incidenza della malattia pneumococcica a livello mondiale che rappresenta una delle principali cause di mortalità infantile nei paesi in via di sviluppo. Fra i 90 ceppi di SP attualmente noti, uno dei più virulenti è quello di tipo 14 (SP14) e per il quale è noto che l’unità ripetitiva tetrasaccaridica (1: R= Me, X:CH2OH Figura 1) costituisce l’unità minima capace di indurre, una volta coniugata ad una proteina immunogenica, una risposta anticorpale specifica contro SP14.
Il lavoro svolto in questa tesi si inserisce in un più ampio progetto volto alla sintesi di analoghi zwitterionici (4, 6 e 7 Figura 1) del tetrasaccaride costituente l’unità ripetitiva del CPS di SP14, che si differenziano per la distanza fra il centro cationico e quello anionico, per la locazione delle cariche sulle diverse unità monosaccaridiche e/o sull’aglicone, con lo scopo di valutarne le loro proprietà immunogeniche. Per ottenere un insieme di dati che potessero essere esplicativi di come l’introduzione delle diverse cariche all’interno del tetramero potessero modificarne l’attività immunologica, per ogni target zwitterionico è stata progettata anche la sintesi degli analoghi a singola carica (catione: 3 e 5 o anione: 2) e il derivato neutro (1), considerato il riferimento comune.

Figura 1


Test preliminari volti a valutare l’attività immunonogenica dei tetrasaccaridi 1-4 avevano evidenziato sia un’ottima biocompatibilità e sia una buona capacità a legare l’anticorpo specifico contro lo SP14.
Nello specifico, l’obiettivo della mia tesi ha riguardato la preparazione del tetrasaccaride cationico 5 e del derivato zwitterionico 7 (Figura 1) seguendo l’approccio sintetico illustrato nello Schema 1. In particolare la preparazione del derivato 7, necessita la preliminare preparazione del tetrasaccaride 18 avente un gruppo ortogonale sulla posizione C-6’’’ che, dopo selettiva de- protezione, fornisce il derivato 19 su cui realizzare la successiva reazione di coupling con un’opportuna unità fosfocolinica seguita da completa rimozione dei gruppi protettori presenti sia sulla porzione saccaridica che fosfocolinica.

Schema 1


La sintesi dei tetrasaccaridi 17-18 (Schema 1) ha richiesto la preliminare preparazione di building blocks disaccaridici del lattosio (15-16) e della lattosamina (13-14) da usare, rispettivamente come glicosil donatori e glicosil accettori in una -glicosidazione stereoselettiva. I donatori 15-16 sono stati ottenuti dal lattosio, mentre la sintesi degli accettori 13-14 ha previsto la preparazione del glicosil accettore 4-OH--D-glucosammico (8) seguita da -galattosidazione con i donatori 9-10 e rimozione selettiva del gruppo t-butildimetilsililico in posizione 6.

a) Preparazione dei glicosil tricocloroacetoimmidati 9-10 e 15-16 (Schema 1)

I derivati -tricloroacetoimmidati 10 e 15, noti in letteratura, sono stati preparati a partire, rispettivamente, dal D-galattosio e D-lattosio mediante acetilazione convenzionale (Py-Ac2O) a dare i corrispondenti derivati peracetilati, deprotezione selettiva della posizione anomerica (NH2NH2.AcOH, DMF, 60°C) e successivo trattamento con CCl3CN in presenza di DBU.
La preparazione del donatore lattosidico 16 ha richiesto la preliminare preparazione del derivato 24, a partire dal noto 20 (Schema 2) su cui effettuare l’introduzione di un gruppo protettore ortogonale come quello allilico (AllBr/NaH in DMF) sulla posizione primaria libera. L’idrolisi acida controllata (AcOH 60%, t.a.) seguita da isopropilidenazione selettiva delle posizioni 5 e 6 (2Mp, PyOHTs in CH2Cl2) ha fornito il diolo 22 che è stato convertito in 24 mediante benzilazione delle posizioni 3’ e 4’ (BnBr, NaH, DMF), rimozione delle funzioni acetaliche (AcOH 80%, 80°C) e acetilazione convenzionale (Py-Ac2O). La trasformazione di 24 nell’-tricloroacetoimmidato 16 è realizzata applicando la stessa metodologia sintetica descritta nella preparazione di 10 e 15.
Schema 2

Il derivato -tricloroacetoimmidato 9, avente in posizione 6 un gruppo azidico precursore del centro cationico, è stato preparato (Schema 3), a partire dal diacetongalattosio commerciale 25, applicando la stessa metodologia utilizzata nella sintesi dei donatori 10 e 15, previa conversione nell’azide 28 per sostituzione nucleofila SN2 del tosile in posizione 6 (NaN3, DMF, TBAI), seguita da rimozione delle funzioni acetaliche (AcOH 80%, 80°C) e acetilazione convenzionale (Py-Ac2O).

Schema 3



b) Preparazione dei glicosil accettori 8 e 13-14 (Schema 1)

La sintesi del glicosil accettare 4OH--D-glucosamminco 8 (Schema 4) è realizzata attraverso una metodologia già messa a punto in laboratorio. Precursore chiave della sintesi di 8 è l’-ossazolidina 29 efficacemente preparata a partire dal cloridrato della D-glucosammina commerciale previa acetilazione (Py-Ac2O) seguita da trattamento con un promotore acido (TMSOTf) in DCE anidro. L’apertura nucleofila regioselettiva di 29 con MeOH in presenza di un catalizzatore acido (CSA) in DCM anidro ha fornito il β-glicoside 30 che è convertito nell’alcol 31 per completa rimozione dei gruppi esterei (MeONa-MeOH) seguita da isopropilidenazione selettiva delle posizioni 4,6 (2-MP, CSA, DCM).

Schema 4


La benzilazione della posizione 3 (BnBr, KOH, THF, 18-crown-6) e la successiva rimozione dell’acetonuro per idrolisi acida blanda (AcOH aq 70%, 40°C) ha fornito il diolo 32, efficacemente trasformato nell’accettore 8 per trattamento con t-butildimetilsililcloruro (TBDMSCl, Py), un reagente ingombrante in grado di proteggere regioselettivamente il più reattivo ossidrile primario.
La sintesi degli accettori lattosamminici 13 e 14 (Schema 1) è stata realizzata utilizzando le condizioni di glicosidazione messe a punto in ricerche precedenti nell’ambito della sintesi dei tetrasaccaridi 1-4 (Figura 1). La β-galattosidazione di 8 condotta con un eccesso (1.5 eq) di donatore 9 o 10, TMSOTf come promotore acido, in DCM anidro e in presenza di setacci molecolari (AW-300) ha fornito i disaccaridi 11 e 12. La successiva rimozione selettiva della protezione silileterea sul C-6 mediante idrolisi acida blanda (AcOH aq. 70%, 70°C) fornisce i desiderati accettori lattosamminici 13 e 14 in buona resa.

c) Preparazione dei tetrasaccaridi 17-19 (Schema 1)

L’ultimo passaggio chiave della sequenza sintetica per ottenere i tetrasaccaridi 17 e 18 ha previsto una reazione di glicosidazione rispettivamente fra l’accettore lattosamminico 13 e il donatore 15, e l’accettore 14 e il donatore 16 (Schema 1) utilizzando come promotore acido il BF3.Et2O e conducendo la reazione in DCM anidro a temperatura ambiente.
La conversione del derivato 18 nel tetrasaccaride 19, selettivamente deprotetto al C-6’’’, è stata effettuata mediante rimozione selettiva del gruppo allilico per trattamento con PdCl2 in una miscela EtOH-MeOH 1:1. Il derivato neutro 19 sarà utilizzato in ricerche successive per la preparazione del tetrasaccaride zwitterionico 7 attraverso coupling con una opportuna unità fosfocolinica.

d) Preparazione del tetrasaccaride cationico 5 (Figura 1) e test biologici

La trasformazione del tetrasaccaride 17 nel corrispondente target cationico 5, isolato puro mediante flash cromatografia in fase inversa, è stata realizzata attraverso idrogenazione catalitica (Pd/C 10%, MeOH-AcOEt), che permette sia la rimozione del gruppo benzilico che la riduzione del gruppo azidico ad amminico, seguita da trattamento basico con ammoniaca metanolica.
Con l’ottenimento del derivato cationico 5 e del tetrasaccaride neutro 19 è stato raggiunto l’obiettivo prefissato in questo lavoro di tesi.
Il tetrasaccaride 5 insieme al corrispettivo neutro (1), anionico (2) e zwitterionico (6) precedentemente sintetizzati in laboratorio, sono stati inviati alla Prof.ssa Lombardi dell’Università degli Studi del Piemonte Orientale, che li ha sottoposti a saggi preliminari volti a determinarne l’attività immunogenica contro le infezioni da Streptococcus Penumoniae 14 (Sp14). Tutti i composti sono risultati biocompatibili, non riducono la proliferazione cellulare, sono riconosciuti dall’anticorpo e risultano essere più attivi di un ordine di grandezza rispetto al SP-14 naturale commerciale, anche se meno efficaci.