• TNF-alpha
• osteoblastogene
• desensitizzazione
• A2B

L’osso è un tessuto connettivo che, grazie all’azione di specifiche cellule, gli osteoblasti e gli osteoclasti, è sottoposto ad un continuo processo di rimodellamento. In particolare, gli osteoclasti sono le cellule deputate al riassorbimento osseo, mentre gli osteoblasti sono quelle abilitate alla mineralizzazione e alla sintesi della matrice ossea.
L’osteoporosi è una patologia causata da una diminuzione della densità ossea, che porta con il tempo ad un aumento della fragilità ed anche ad un aumento del rischio di fratture. Ad oggi per questa malattia, sono in atto numerose terapie; esse possono essere di tipo anabolico, quindi mirate ad aumentare la rigenerazione ossea, oppure di tipo catabolico, che vanno a diminuire la perdita di mineralizzazione delle ossa, agendo a livello degli osteoclasti.
Per quanto riguarda le terapie anaboliche, sono in atto numerosi studi volti alla formazione di osteoblasti a partire dai loro precursori, le cellule mesenchimali staminali (MSC). Tali cellule infatti in grado di differenziarsi in vari fenotipi cellulari, tra cui anche gli osteoblasti.
Il differenziamento delle cellule MSC a osteoblasti è un processo controllato da vari recettori, accoppiati con proteine G, i quali agiscono tramite vie intracellulari di attivazione, agendo sull’espressione di specifici fattori di trascrizione coinvolti nel differenziamento, tra i quali troviamo il Runx-2, l’Osterix.
Tra i GPCR, recentemente, nei nostri lavori, è stato dimostrato che il recettore A2B per le purine gioca un ruolo importante nel processo osteogenico.
Il recettore A2B appartiene alla superfamiglia dei recettori accoppiati alle proteine G (GPCR), cioè sono recettori a sette eliche trans-membrana ed in particolare è accoppiato prevalentemente a proteine di membrana di tipo Gs, cioè stimolatorie. La sua attivazione comporta un aumento della quantità di cAMP intracellulare. Il recettore A2B ha il ruolo di indurre il differenziamento delle MSC ad osteoblasti, in particolare nelle prime fasi di tale processo. È noto che le risposte mediate dai GPRC, in condizioni patologiche, vengono regolate da citochine infiammatorie, tra cui è interessante la risposta del Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α).
Numerosi studi riportano che nella prima fase del danno dell’osso questa citochina pro-infiammatoria, il TNF-α, a basse concentrazioni giochi un ruolo chiave nella rigenerazione del tessuto osseo, andando ad agire nella differenziamento delle mesenchimali ad osteoblasti. Il ruolo del TNF-α è stato anche definito “dualistico” nei confronti della rigenerazione dell’osso: infatti a concentrazioni basse agisce in modo pro-osteogenico, inducendo una rigenerazione dell’osso, invece a concentrazioni più alte ed in una fase cronica del danno induce una diminuzione della densità ossea, dovuta alla distruzione di questo tessuto.
Diversi studi in letteratura hanno riportato che il TNF-α è in grado di esercitare un’azione regolatoria sull’espressione e sulla funzionalità dei GPCR ; in particolare l’azione della citochina sembra coinvolgere un’azione sulle GRK (GPCR regulatory Kinases), proteine regolatorie che intervengono nel processo di desensitizzazione recettoriale, che avviene dopo uno stimolo prolungato con l’agonista.
Alcuni studi hanno riportato un’azione regolatoria da parte del TNF-α anche nei confronti del recettore A2B; in questi studi, si riporta un aumento o una diminuzione della funzionalità del recettore stesso, a seconda della durata del trattamento della citochina. Non sono, tuttavia, noti dati sulla modulazione di tale recettore da parte del TNF-α a livello del tessuto osseo.
Lo scopo della mia tesi è quello di valutare l’effetto del TNF-α sull’espressione e sulla funzionalità del recettore A2B, durante il processo di differenziamento delle cellule mesenchimali umane ad osteoblasti.
A basse dosi il TNF-α ha dimostrato un effetto pro-differenziante, favorendo il fenotipo osteogenico, senza dare alterazione della vitalità cellulare.
La citochina ha inoltre dimostrato di potenziare l’effetto osteogenico, promosso dall’agonista selettivo per il recettore A2B, il BAY-606583.
Attraverso la misurazione dell’accumulo di cAMP, abbiamo analizzato le cinetiche di desensitizzazione del recettore A2B, in presenza e in assenza del TNF-α. I risultati hanno dimostrato che, a tutti gli stadi di differenziamento delle MSC analizzati, la citochina è in grado di aumentare significativamente la risposta del recettore all’agonista BAY-606583, e quindi la sua funzionalità.
Utilizzando tecniche di analisi Real-time POCR e western blotting, abbiamo, inoltre, dimostrato che l’effetto di modulazione del recettore è dovuto all’azione sull’espressione delle GRK-2, la più importante proteina ad attività chinasica coinvolta nella desensitizzazione dei recettori adenosinici. Infatti, il TNF-α è risultato in grado di diminuire significativamente l’espressione della chinasi l’associazione della GRK-2 al recettore adenosinico A2B.
I risultati ottenuti hanno confermato che il TNF-α agisce inibendo la chinasi GRK-2, promuovendo un effetto positivo sull’espressione del recettore A2B e quindi un aumento del differenziamento delle cellule mesenchimali ad osteoblasti. In conclusione, tali dati hanno contribuito a chiarire il ruolo del TNF-α nel processo di differenziamento delle MSC ad osteoblasti, nonché la sua azione regolatoria sulla funzionalità del recettore A2B. Tali risultati indicano, inoltre, che la desensitizzazione dei GPCR gioca un ruolo fondamentale nell’osteoblastogenesi, e che la sua regolazione potrebbe rappresentare una strategia innovativa per favorire il rimodellamento osseo.