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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-10092008-122916


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
SINISCALCO, AMELIA
URN
etd-10092008-122916
Titolo
Espressione degli enzimi del sistema metabolizzante i farmaci nel tessuto cardiaco di suino: effetti del trattamento con beta-naftoflavone e rifampicina
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE FISIOPATOLOGICHE GENERALI
Relatori
Relatore Dott. Gervasi, PierGiovanni
Parole chiave
  • Nessuna parola chiave trovata
Data inizio appello
27/10/2008
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
27/10/2048
Riassunto
Gli enzimi coinvolti nel sistema metabolizzante i farmaci svolgono importanti funzioni per gli organismi. Essi vengono classificati in base al tipo di reazione che sono in grado di catalizzare. Distinguiamo così enzimi di fase 1, capaci di svolgere reazioni di funzionalizzazione, come i citocromi P450 (CYP), enzimi di fase 2 che catalizzano reazioni di coniugazione come la glutatione-S-trasferasi ed enzimi antiossidanti fra cui la catalasi e la superossido dismutasi. Nei mammiferi, molti di questi enzimi possono venire indotti da xenobiotici tramite l’attivazione di specifici recettori quali l’Aryl Hydrocarbons Receptor (AhR), il Costitutive Androstane Receptor (CAR) e il Pregnane X Receptor (PXR). La maggior parte delle conoscenze disponibili su questo processo di induzione riguardano il tessuto epatico. Gli idrocarburi policiclici, come il beta-naftoflavone (bNF), agiscono tramite AhR e regolano l’espressione dei P450 1A1, 1A2 e 1B1 di alcuni enzimi antiossidanti e di fase 2. Gli antibiotici, quali la rifampicina (RIF), tramite PXR e CAR regolano l’espressione dei CYP2B, dei CYP3A e della glutatione-S-tranferasi. Per quanto riguarda gli organi extraepatici sono disponibili limitate informazioni.
L’obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di caratterizzare l’espressione basale di alcuni enzimi coinvolti nel “drug metabolism” in tessuti cardiovascolari di suino, attraverso lo studio della trascrizione genica, dell’attività enzimatica e/o dei livelli proteici e di valutare gli effetti prodotti su essa da due composti esogeni, il beta-naftoflavone (bNF) e la rifampicina (RIF). In tutte le indagini, il tessuto epatico è stato preso come riferimento positivo. Nel sistema cardiovascolare le isoforme di citocromo P450, svolgono importanti funzioni fisiologiche; inoltre è sempre più evidente una correlazione fra patologie cardiovascolari e deregolazione dell’espressione di questi enzimi. Il modello animale scelto per il nostro studio è stato il suino poiché tale specie è poco studiata dal punto di vista metabolico, nonostante sia stata proposta come nuovo modello sperimentale per gli studi di farmacologia e tossicologia. Sono stati selezionati 16 suini di 25-30 Kg provenenti da tre lotti diversi così distribuiti: 6 animali nel 1° lotto (3 controlli e 3 trattati con bNF 30 mg/Kg); 4 animali nel 2° (2 controlli e 2 trattati con bNF 30 mg/Kg) e 6 animali nel 3° (3 controlli e 3 trattati con RIF 40 mg/Kg). I trattamenti sono stati eseguiti i.p. per 4 giorni. Dagli animali del 1° e del 3° lotto sono stati prelevati il cuore e il fegato mentre da quelli del secondo sono stati prelevati porzioni corrispondenti ai quattro comparti cardiaci, alle arterie coronarie e al fegato. Nelle frazioni cardiache microsomiali, provenienti da animali del 1° e del 2°, sono state determinate le attività etossiresorufina O-deetilasi marcatrice principale del CYP1A1, metossiresorufina O-demetilasi marcatrice del CYP1A2 e 7-etossi 4-(trifluorometil)cumarina O-deetilasi marcatrice dei CYP 2B, 1A1/2. I risultati hanno mostrato, in seguito al trattamento con bNF, un aumento significativo di queste attività marcatrici sia nel cuore in toto sia nei comparti cardiaci. Questi risultati sono stati confermati anche a livello proteico mediante esperimenti di Western Blotting con anticorpi anti-CYP1A di ratto. Sui campioni provenenti dagli animali del 1° lotto sono stati eseguiti esperimenti di RT-PCR preliminari i quali hanno evidenziato la capacità del bNF di determinare un aumento della trascrizione genica del CYP1A1 e del CYP1B1. Indagini di Real-Time PCR, condotte a livello dei comparti e delle arterie coronarie hanno evidenziato che il CYP1B1 è l’isoforma appartenente alla famiglia 1 maggiormente espressa nel tessuto cardiovascolare. Il trattamento con bNF ha evidenziato un aumento del trascritto di tutti i P450 a livello di tutti i comparti ma non del CYP1B1 nelle arterie coronarie. L’isoforma maggiormente indotta dal bNF è risultata essere il CYP1A1. Nelle frazioni citosoliche ottenute dagli animali del 1° lotto sono state determinate le attività dei seguenti enzimi antiossidanti e detossificanti: superossido dismutasi, catalasi, glutatione perossidasi, glutatione reduttasi, DT-diaforasi e glutatione-S-tranferasi. Esse non hanno mostrato alcun aumento significativo in seguito al trattamento.
Nelle frazioni microsomiali provenienti da animali di controllo e pretrattati con RIF sono state eseguite le seguenti attività: 7-etossi-4(trifluorometil)cumarina O-deetilasi marcatrice del CYP2B e la benzilossichinolina debenzilasi dipendente dal CYP3A. I risultati hanno mostrato che il trattamento con RIF è in grado di indurre queste attività nel fegato ma non nel cuore. I risultati di attività per i CYP3A sono stati confermati mediante analisi immunologiche. Infine attraverso analisi di RT-PCR abbiamo rivelato la presenza dell’RNA messaggero delle isoforme dei CYP 2B22, 3A22, 3A39, 3A46 a livello cardiaco oltre che a livello epatico. Nel cuore l’espressione di geni che codificano queste isoforme non è modulata dal trattamento con RIF. Tale fenomeno potrebbe essere dovuto alla mancanza dei recettori nucleari CAR e PXR, dal momento che i loro trascritti non sono stati rilevati a livello cardiaco. Nelle frazioni citosoliche, sono state eseguite le attività antiossidanti e detossificanti già considerate in precedenza. A livello cardiaco il trattamento con RIF ha influenzato la DT-diaforasi, la GST e la SOD, il cui meccanismo rimane ancora da chiarire.
I risultati ottenuti hanno evidenziato che, a livello cardiaco, solo il trattamento con bNF è risultato in grado di modulare l’espressione dei citocromi P450. Ciò può avere implicazioni importanti per l’omeostasi cardiovascolare, infatti possono essere alterate vie endogene importanti nelle quali sono coinvolti P450 della famiglia 1. Inoltre, vista la capacità di queste isoforme di produrre ROS e di bioattivare gli idrocarburi policiclici a composti in grado di formare addotti con il DNA, si possono determinare dei disordini cardiovascolari dovuti ad un’eccessiva proliferazione cellulare quali ipertrofia e aterosclerosi.

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