• CIPP
• PDZ
• Xenopus laevis

Le proteine multi-PDZ sono caratterizzate dalla presenza di copie multiple di un particolare tipo di domini funzionali, chiamati PDZ dal nome delle prime tre proteine in cui furono scoperti (PSD95, Dlg, ZO-3). In generale la loro funzione è quella di costituire un’impalcatura molecolare per tenere unite tra loro varie proteine e di indirizzare questi complessi verso specifici siti subcellulari.
A tale famiglia appartiene la proteina di topo CIPP (Channel-Interacting PDZ domain Protein), il cui gene è localizzato sul cromosoma 4. Attualmente si conoscono sei isoforme murine di CIPP, derivanti per la maggior parte da processi di splicing alternativo, che differiscono nel numero dei domini PDZ e nella presenza di un dominio MRE/L27 localizzato vicino al terminale amminico. La grande variabilità nel numero e nel tipo di domini suggerisce che ciascun PDZ possa avere un ruolo diverso nella formazione dei vari complessi multiproteici.
Scopo di questa tesi è stato caratterizzare l’espressione tessuto specifica delle varie isoforme nel topo e distinguere le funzioni specifiche associate ai vari PDZ. Esperimenti di RT-PCR su RNA estratto da tessuti di topo adulto, hanno permesso di analizzare la distribuzione di cinque delle sei isoforme di mRNA, mediante l’utilizzo di primers specifici. Nel cervello prevale l’isoforma CIPP-3, costituita da solo quattro domini PDZ e mancante del dominio ammino terminale MRE/L27. Nell’occhio e nel rene prevale l’isoforma CIPP-1, contenente il dominio MRE/L27 e 10 domini PDZ, mentre altre isoforme sembrano esclusivamente espresse solo in altri organi. Inoltre, è stata condotta un’analisi più dettagliata della distribuzione dei trascritti relativi alle due isoforme CIPP-1 e CIPP-3 nel cervello di topo adulto, mediante ibridazioni in situ su sezioni, che hanno permesso di individuarne l’espressione nel cervelletto, nell’ippocampo e nella corteccia cerebrale.
Allo scopo di estendere questo studio al sistema modello di Xenopus laevis sono state condotte ricerche in banca dati, che hanno evidenziato la presenza di due sequenze EST corrispondenti al gene ortologo XCIPP. A partire da queste sono stati disegnati primers specifici, che hanno permesso attraverso esperimenti di RT-PCR, clonaggio e sequenziamento di ricostruire la sequenza di un cDNA full-length di X. laevis, che rispetto al clone murino dell’isoforma a 10 PDZ, presenta un dominio PDZ aggiuntivo all’estremità carbossi-terminale. Al fine di ottenere informazioni sul pattern spazio-temporale dell’espressione genica di XCIPP sono stati condotti esperimenti di ibridazione in situ whole mount, su embrioni a diversi stadi di sviluppo, e su sezioni di retina di embrioni a stadio 42.
In parallelo per studiare anche la distribuzione delle proteine corrispondenti è stato prodotto un anticorpo policlonale specifico contro una regione di 121 amminoacidi tra il settimo e l’ottavo dominio PDZ. Tale anticorpo è stato utilizzato in esperimenti preliminari mediante Western Blotting, che indicano la presenza della proteina XCIPP a stadi precoci dello sviluppo di X. laevis.
Lo studio dei trascritti corrispondenti al gene ortologo di Xenopus e la possibilità di identificarne i prodotti proteici con un anticorpo specifico, apre la possibilità di condurre in futuro studi in vivo, mediante iniezione in embrioni a vari stadi di sviluppo, per verificare direttamente il ruolo delle varie isoforme in tessuti diversi.