• Noggin
• retina
• staminali embrionali
• ES

Nel laboratorio dove si è svolto il mio lavoro di tesi è stato precedentemente dimostrato il ruolo del fattore secreto noggin nell’induzione di un destino retinico nell’embriogenesi di Xenopus laevis. Questo organismo, infatti, rappresenta un buon modello per lo studio della funzione genica e dello sviluppo dell'occhio. Le cellule animali della blastula (animal cap) di questo organismo, una volta espiantate, possono essere indotte a differenziare in derivati dei tre foglietti embrionali attraverso trattamento con opportuni fattori di crescita o tramite microiniezioni di specifici mRNA (sovraespressione). Queste cellule rappresentano dunque cellule in grado di assumere numerosi destini differenziativi diversi. Studi precedenti realizzati nel nostro laboratorio hanno dimostrato che la sovraespressione mediante microiniezione di noggin è in grado di indurre un destino retinico multipotente nelle cellule di “animal cap” di X. laevis. Tuttavia, in prospettiva di una possibile estensione all’uomo dei risultati ottenuti, con la speranza di un’applicazione terapeutica nel campo delle patologie degenerative della retina, gli Anfibi non rappresentano il sistema modello più appropriato. E’ dunque necessario verificare che risultati simili si possano ottenere anche nei Mammiferi, a partire da modelli in vitro e passando successivamente a sistemi in vivo.
Scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di analizzare l’azione di noggin in vitro, su colture di cellule staminali embrionali (ES) di origine murina.
In un primo momento ho dovuto mettere a punto un protocollo di differenziamento di tali cellule, tale da indirizzarle verso un generico destino neuronale. In letteratura sono riportati vari protocolli di differenziamento, che in partenza sfruttano
- corpi embrioidi in sospensione
- colture di ES in adesione
Ho quindi preso in esame tre protocolli basati su entrambi i metodi per ottenere precursori neurali; l’avvenuto differenziamento neuronale è stato verificato mediante estrazione di RNA in momenti diversi della procedura, seguita da real time PCR per i seguenti marcatori
- nestin: espresso nei precursori neurali
- neurofilament-L: marker di differenziamento neurale.
In un secondo momento ho somministrato la proteina Noggin a tali colture per analizzare una sua possibile capacità come induttore di destino retinico.
Allo scopo di caratterizzare l’efficienza dei protocolli di differenziamento, ho analizzato i risultati mediante una procedura di immunocitochimica, volta a confrontare la percentuale di cellule che esprimono rodopsina nelle cellule trattate con Noggin rispetto alle colture di controllo. Parallelamente ho estratto l’RNA e ne ho effettuato una retrotrascrizione, per effettuare una real time PCR comparativa per vari geni come ad esempio rhodopsin, pax6, crx, rax, implicati nel differenziamento retinico, con particolare attenzione al destino fotorecettoriale.