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Le Universal Stress Proteins (USP) sono proteine sovraespresse in risposta a molteplici situazioni di stress e che svolgono un’azione protettiva nei confronti degli organismi in cui si ritrovano. Sono codificate da una superfamiglia di geni presenti in batteri, archea, funghi, protozoi e piante. Ogni USP presenta uno o più domini conservati di 140 – 160 amminoacidi associati, in alcune proteine della superfamiglia, anche ad altri domini funzionali. In studi condotti sui microrganismi Methanoccocus jannaschii e Haemophilus influenzae è stata riscontrata, in entrambi i casi, la capacità di queste proteine di formare dimeri e, nelle USP appartenenti a M. jannaschii, la presenza di una sequenza amminoacidica in grado di legare l’ATP. Questa sequenza, che è stata ritrovata solo in alcune USP, ha portato ad una suddivisione della superfamiglia in due grandi gruppi: proteine USP M. jannaschii – like, contenenti il motivo di legame per l’ATP, e proteine USP H. influenzae – like, sprovviste di tale sequenza. In Arabidopsis thaliana, per esempio, l’analisi della sequenza di 44 geni USP omologhi a geni batterici ha evidenziato una derivazione di questi geni, e dei relativi prodotti proteici, da un antico gene M. jannaschii – like, suggerendo una maggior diffusione tra gli organismi vegetali di questa tipologia di prodotti genici rispetto al gruppo di proteine H. influenzae – like. Molti studi svolti principalmente in batteri e nelle piante hanno dimostrato un coinvolgimento delle USP nella tolleranza a diverse situazioni di stress quali, per esempio, le elevate temperature, condizioni di elevata salinità, stress da ipossia e presenza di composti tossici. I meccanismi biochimico-molecolari che permettono alle USP di conferire resistenza agli stress, tuttavia, sono stati ancora scarsamente investigati. Lo scopo di questa tesi è stato quello di caratterizzare una USP M. jannaschii – like di Populus alba (pioppo bianco). La proteina (PaUSP) è stata selezionata a partire da studi condotti su una proteina omologa di un clone di pioppo P. x euroamericana che, da un’analisi genome-wide di espressione genica differenziale mediante RNA-sequencing, è risultata essere sovraespressa nelle radici di piante cresciute in presenza di concentrazioni sub-letali di zinco. Il lavoro di tesi ha permesso la definizione di un protocollo di purificazione della proteina ricombinante, che è stata prodotta in Escherichia coli come proteina di fusione con una Maltose Binding Protein (MBP). L’isolamento della proteina di interesse è stato condotto mediante cromatografia di affinità, con la quale è stato possibile rimuovere la MBP e la proteasi impiegata per il taglio della MBP stessa. La proteina purificata è stata quindi utilizzata per studiarne l’azione di chaperone molecolare nei confronti di enzimi target in condizioni di stress termico. È stato selezionato come target l’enzima alcol deidrogenasi di lievito (ADH). Inoltre, mediante microscopia confocale è stata determinata la localizzazione cellulare della PaUSP in cellule epidermiche di foglia e protoplasti di Nicotiana tabacum, trasformati transientemente mediante, rispettivamente, Agrobacterium tumefaciens e glicole polietilenico (PEG). Sono stati utilizzati opportuni costrutti fluorescenti in grado di esprimere la proteina di interesse e proteine marker selezionate con un pattern di localizzazione noto. In aggiunta, è stato avviato l’allestimento di piante transgeniche di Arabidopsis thaliana trasformate con il gene codificante per la proteina stessa.

Universal Stress Proteins (USP) are proteins overexpressed in response to various stress conditions and that carry out a protection of the organisms in which they are found. They are encoded by a superfamily of genes present in bacteria, archea, fungi, protozoa and plants. Each USP has one or more conserved domains of 140 - 160 amino acids associated, in some proteins, with other functional domains. In studies conducted on Methanoccocus jannaschii and Haemophilus influenzae microorganisms, the ability of these proteins to form dimers and, in the USP belonging to M. jannaschii, the presence of an amino acid sequence able to bind ATP, was found. This sequence, which was found only in some USP, led to a division of the superfamily into two large groups: USP M. jannaschii - like proteins, containing the ATP binding motif, and USP H. influenzae - like proteins, without this sequence. In Arabidopsis thaliana, for example, the analysis of the sequence of 44 USP genes homologous to bacterial genes has shown the origin of these genes, and of the related protein products, from an ancient gene M. jannaschii - like, suggesting a greater diffusion among plant organisms of this type of gene products compared to the H. influenzae - like protein group. Many studies carried out mainly in bacteria and plants have shown USP involvement in tolerance to various stresses such as, for example, high temperatures, high salinity, hypoxic stress and the exposure to toxic compounds. The biochemical-molecular mechanisms that allow USP to confer resistance to stress, however, have still been poorly investigated. The purpose of this thesis was to characterize a USP M. jannaschii - like of Populus alba (white poplar). The protein (PaUSP) was selected from studies conducted on a homologous protein of a poplar P. x Euroamerican clone which, from a genome-wide analysis of differential gene expression by RNA-sequencing, was found to be overexpressed in the roots of plants grown in presence of sub-lethal concentrations of zinc. The work allowed the definition of a purification protocol of the recombinant protein produced in Escherichia coli as a fusion protein with a Maltose Binding Protein (MBP). The isolation of the protein of interest was carried out by affinity chromatography, with the removal of the MBP and of the protease used for cutting the MBP itself. The purified PaUSP was therefore used to study its molecular chaperone action against target enzymes in thermal stress condition. The yeast alcohol dehydrogenase enzyme (ADH) was selected as target. Furthermore, the cellular localization of PaUSP in leaf epidermal cells and protoplasts of Nicotiana tabacum, transiently transformed by Agrobacterium tumefaciens and polyethylene glycol (PEG), respectively, was determined by confocal microscopy. Suitable fluorescent constructs expressing the protein of interest and selected marker proteins with a known localization pattern have been used. In addition, preparation of transgenic Arabidopsis thaliana plants transformed with the PaUSP gene was started.