• mosaicismo genetico
• microscopia a due fotoni
• sistema inducibile
• ricombinasi cre

La creazione e l'analisi di un mosaico genetico è una potente innovazione applicata agli studi in organismi modello che permette di analizzare i comportamenti delle singole cellule mutanti in un ambiente costituito da cellule wild-type (WT), e di distinguere le funzioni cell-autonomous di singoli geni.
Per studiare l'intero repertorio di funzioni di un gene in vivo, e riprodurre efficacemente determinate patologie umane, il sistema attualmente più efficace è quello di generare mutanti condizionali e inducibili durante lo sviluppo, il progredire della malattia, o l'omeostasi cellulare. Grazie al controllo spazio-temporale garantito da questo sistema è possibile riprodurre un mosaico di inattivazione genica che consenta quindi lo studio più approfondito del ruolo specifico di un gene a livello di singola cellula, o la rappresentazione di una patologia caratterizzata da mosaicismo genetico.
Il metodo più utilizzato per la mutagenesi condizionale nel topo implica la combinazione di un allele "floxato", in cui una regione critica di un gene è fiancheggiata da due siti Lox, bersaglio della ricombinasi Cre, e un transgene che esprime la ricombinasi in uno specifico organo o in specifici tipi cellulari. La ricombinasi Cre è una ricombinasi a tirosina proveniente dal batteriofago P1 che trova largo impiego in applicazioni di biologia molecolare. Questo enzima è in grado di catalizzare eventi di ricombinazione sito-specifica di regioni comprese fra specifiche sequenze di DNA (siti Lox). Una caratteristica peculiare di questo enzima è quella di produrre eventi di ricombinazione diversi (delezione, inserzione, traslocazione o inversione) delle regioni di DNA collocate fra i due siti Lox, a seconda dell’orientazione reciproca di questi siti. Questa caratteristica è stata sfruttata, quindi, per generare il sistema cosiddetto di “knock-out condizionale”, un sistema in cui l’organismo modello possiede un gene target inattivo (knock-out) solo in certe condizioni tempo e/o tessuto specifiche (condizionale): questi sono animali in cui il gene target è identico al corrispettivo wild type ad eccezione della presenza dei siti Lox che lo fiancheggiano, cosicché facendo esprimere la ricombinasi Cre in modo tempo/tessuto specifico si inattiva il gene target in un determinato momento e tessuto dell’animale, attivando il fenotipo knock-out. Inoltre, al fine di effettuare il knock-out di un gene in un momento scelto arbitrariamente in fase sperimentale, sono state sviluppate forme inducibili della Cre, come CreERT2, che è attiva per ~48h a seguito di somministrazione di Tamoxifen (Tm). Utilizzando diverse concentrazioni di Tamoxifen è possibile creare un mosaico di inattivazione di un gene floxato controllando la frazione di cellule mutate nel tessuto/organo a livello del quale è stata indirizzata l’espressione di Cre inducibile. Esistono diverse metodologie che consentono di distinguere le due popolazioni di cellule di un mosaico, ma quelle attualmente disponibili sono tutte limitate a campioni fissati o colture cellulari, e non consentono la marcatura differenziale delle due sottopopolazioni che costituiscono il mosaico.
Il lavoro di questa tesi ha avuto come obiettivo la messa a punto di una serie di sensori che potessero essere usati come reporter fluorescenti dell'attività ricombinasica su cultura cellulare e in vivo, ovvero, che fossero in grado di cambiare la proteina fluorescente espressa seguito dell'azione della ricombinasi Cre, rendendo rilevabile, tramite emissione di segnale fluorescente, il mosaico di inattivazione genica generato dall’enzima. In particolare, per raggiungere questo scopo sono stati prodotti due tipi di costrutti.
Nel primo costrutto, un promotore CAG è collocato a monte di una sequenza codificante una dsRed seguita da una sequenza IRES-GFP inserita fra due siti LoxP: le cellule trasfettate con questo costrutto esprimono sia la dsRed che la GFP, ma a seguito dell’azione della ricombinasi Cre, la sequenza IRES-GFP viene escissa e la GFP non è più espressa. In questo modo le cellule sane (wild type) emetteranno un segnale fluorescente sia rosso che verde, mentre le cellule knock-out emetteranno un segnale unicamente rosso.
La seconda tipologia di costrutto si basa invece sul sistema “Flex-Switch” dove due proteine fluorescenti, una GFP e una tdTomato, sono inserite con orientazione opposta. In questo secondo tipo di costrutto le due sequenze vengono a trovarsi posizionate fra due coppie eterotipiche di siti Lox la cui particolare orientazione e posizionamento consentono l’inversione della sequenza contenuta fra esse a seguito di attività ricombinasica. Con questo sistema le cellule nelle quali la Cre non è attiva esprimono solo la tdTomato, mentre, dopo attivazione della Cre, non avverrà un’escissione ma un’inversione della sequenza fiancheggiata dai Lox, evento che comporta la sostituzione, a valle del promotore, della tdTomato con la GFP: in questo modo le cellule esprimeranno solo la GFP. Entrambi i costrutti sono stati trasfettati in colture di cellule HEK293T.
Lo sviluppo di questi sensori ha come prospettiva di applicazione quella di rilevare un mosaico di inattivazione genica, ottenuto con sistemi condizionali e inducibili, che rappresenti un modello animale per la sindrome di Rett, una patologia neurologica che si manifesta in età precoce, prevalentemente in individui affetti da mutazione nel gene MeCP2 (methyl-CpG-binding protein-2) localizzato sulla parte distale del cromosoma X. Come altre patologie X-linked, nelle femmine eterozigoti la sindrome di Rett è caratterizzata da un fenotipo a mosaico, dovuto all’inattivazione casuale del cromosoma X, nel quale circa la metà delle cellule del sistema nervoso sono normali, mentre le restanti esprimono la proteina MeCP2 mutata. Quindi uno degli obiettivi del lavoro è di utilizzare i nostri sensori per riuscire ad identificare il mosaico di cellule sane e knock-out tramite l’analisi a due fotoni.