• NGS
• next generation sequencing
• Ion torrent
• neoadiuvante
• neoadjuvant
• anthracycline
• antracicline
• TNBC
• responder
• outcome
• tumore alla mammella
• breast cancer
• Triple negative

Recenti studi evidenziano come mutazioni in geni coinvolti nel riparo del DNA, oltre ai principali geni di predisposizione BRCA1 e BRCA2, possono aumentare il rischio di sviluppare cancro alla mammella e alle ovaie. La risposta a determinate terapie dipende fortemente da eventuali alterazioni genetiche germinali o tumore-specifico all'interno di questi geni. Alcuni tumori sporadici, o in pazienti non selezionati per storia familiare, mostrano proprietà cliniche, patologiche e molecolari simili ai tumori ereditari BRCA-mutati, una condizione definita BRCAness. Tra questi ci sono alcuni tra i tumori che non esprimono i recettori ormonali (ER e PR) e Her2, definiti tripli negativi (Triple Negative Breast Cancer, TNBC): essi rispondono alla chemioterapia con agenti alchilanti, in modo simile ai BRCA mutati, ma hanno un alto rischio di recidiva e di progressione della malattia. Al fine di sviluppare terapie più mirate per questo specifico sottotipo di tumore, potrebbe essere rilevante individuare una correlazione tra la risposta alla terapia neoadiuvante con antracicline e taxani ed eventuali mutazioni germinali in geni principalmente coinvolti nel riparo del DNA. Con il fine di caratterizzare i TNBC è stata testata la presenza di mutazioni germinali nei geni BRCA1, BRCA2, CHEK2, BRIP1, PALB2, TP53, PTEN, STK11, CDH1, BARD1, MLH1, MRE11A, MSH2, MSH6, MUTYH, NBN, PMS1, PMS2, RAD50, RAD51C, RAD52, 53BP1, PARP1, ERCC1, coinvolti principalmente nei meccanismi di riparazione del DNA, tramite la tecnologia Next Generation Sequencing (NGS) “Ion Torrent” in pazienti trattati con terapia neoadiuvante con taxani e antracicline. Sono state selezionate 16 pazienti con TNBC in terapia neoadiuvante con almeno 3 cicli di FEC (Fluorouracile, Epirubicina, Ciclofosfamide) e taxani presso il Polo Oncologico del Santa Chiara di Pisa. Per ciascuna paziente è stato collezionato un campione di sangue periferico, da cui è stato estratto il DNA genomico. La strategia adottata per il sequenziamento è quella del target-resequencing. La costruzione delle librerie è stata effettuata con PCR multiplex. Con il software “Ion AmpliSeq™ Designer” è stato costruito un pannello di primers per analizzare le sequenze codificanti e le regioni fiancheggianti gli esoni dei geni selezionati. Le librerie di ampliconi sono state costruite in modo tale di poter analizzare più pazienti contemporaneamente, utilizzando dei barcode nucleotidici. Ogni libreria è stata purificata e amplificata clonalmente sulla superficie di microsfere, successivamente caricate su un chip semiconduttore. Il sequenziamento è stato effettuato con il sequenziatore “Personal Genome Machine” (PGM). La raccolta e l’elaborazione dei dati è stata eseguita dalla workstation Torrent Suite (TS). I file VCF sono stati generati dal sofware “Ion Reporter 1.6” ed i file BAM e BAI sono stati visualizzati con Interactive Genome Viewer (IGV), per identificare eventuali artefatti di sequenza. L’annotazione delle varianti è stata eseguita con wANNOVAR e con Variant Effect Predictor (VEP). In seguito al sequenziamento NGS sono state ottenute 232 varianti. Di queste, 110 varianti sono di tipo esonico, 132 varianti cadono in regioni non codificanti. Per selezionare le varianti probabilmente deleterie, le varianti esoniche sono state filtrate con i software di predizione di deleteriosità e conservazione SIFT, PolyPhen-2, LRT, Mutation Taster e PhyloP per rimuovere le varianti neutrali. Sono state considerate anche le varianti di splicing e le In/Del eterozigosi non localizzate in regioni omopolimeriche. Sono state selezionate 34 varianti uniche e 5 presenti in più pazienti. In seguito a sequenziamento diretto sono state confermate 28 mutazioni. Per approfondire il significato funzionale di queste varianti è stato fatto un confronto con la letteratura scientifica e con i principali database di varianti (LOVD, BIC, dbSNP), concludendo che 12 varianti predette deleterie hanno un effetto neutrale, mentre le restanti 16 sono probabilmente deleterie. In cinque pazienti non è stata identificata alcuna mutazione deleteria. È possibile osservare la tendenza ad una migliore risposta alla terapia nei pazienti con almeno una mutazione patogenetica. Questo risultato andrebbe confermato aumentando la coorte dei pazienti analizzati per poter osservare differenze statisticamente significative.
Questo studio ha evidenziato le potenzialità dell’approccio NGS, per l’analisi di molti geni in tempi ristretti. In questo lavoro sono state identificate 6 mutazioni mai osservate prima che necessitano di un’ulteriore indagine per chiarine il significato funzionale, e l’eventuale loro coinvolgimento nella tumorigenesi. Inoltre, ha permesso di identificare delle mutazioni con chiaro significato patogenetico, anche su geni che normalmente non sono analizzati nella consulenza genetica per il tumore alla mammella, in pazienti senza sospetta familiarità. Questo lavoro può porre le basi per uno studio più ampio che potrebbe avere ripercussioni utili dal punto di vista clinico e che potrebbe indirizzare verso nuove scelte terapeutiche.