• BRCA1
• Saccaromyces cerevisiae

Il gene umano BRCA1 è un oncosoppressore che codifica per una proteina appartenente ad un complesso multiproteico coinvolto nella riparazione del DNA. È stato ampiamente dimostrato che, nelle donne, una mutazione del gene BRCA1 determina l’80% di rischio di sviluppare cancro al seno ed il 55% di rischio di sviluppare cancro ovarico.
Nel laboratorio dove ho svolto la tesi, è stato messo a punto un saggio in Saccharomyces cerevisiae che permette di distinguere le mutazioni missenso di BRCA1 associate a tumore dai polimorfismi o varianti neutre. È stato dimostrato che l’espressione di BRCA1 mutato aumenta la ricombinazione omologa mitotica in lievito.
Poiché gli stessi “pathway” di riparazione e ricombinazione del DNA presenti nelle cellule umane si ritrovano anche nel lievito Saccharomyces cerevisiae, abbiamo cercato di approfondire l’effetto di BRCA1 nella riparazione del DNA in questo organismo modello. È noto dalla letteratura che i domini maggiormente implicati nel giusto funzionamento della proteina sono quelli all’estremità ammino e carbossi terminale; per questo motivo le varianti neutre e patogenetiche considerate ricadono in queste posizioni ed in particolare sono: K45Q, C61G, R1751Q, M1775R.
L’obiettivo finale di questo progetto è utilizzare il lievito come sistema genetico modello per chiarire il ruolo di BRCA1 nella cancerogenesi; in particolare, lo scopo della tesi è determinare se BRCA1 influenza la riparazione e la ricombinazione in lievito.
Abbiamo dapprima misurato, con esperimenti di Real-Time PCR e Western blot, i livelli d’espressione in lievito delle quattro varianti considerate, sia come proteine “full length” che fuse al cromoforo “mCherry”, e paragonate con il corrispondente BRCA1 wild-type. In seguito, abbiamo determinato l’effetto dell’espressione di BRCA1 wild-type e delle varianti sulla sopravvivenza e ricombinazione mitotica indotta da metil metansulfonato (MMS). Infine, mediante microscopia a fluorescenza, abbiamo valutato la localizzazione di BRCA1-mCherry in cellule di lievito trattate con MMS.
I risultati del Western blot hanno evidenziato che il livello di BRCA1 wild-type è maggiore di quello raggiunto dalle varianti. Gli esperimenti di Real-Time PCR indicano che la variante BRCA1-C61G viene espressa ad un livello minore rispetto a BRCA1 wild-type, mentre la variante BRCA1-M1775R viene espressa ad un livello simile a BRCA1 wild-type; nel caso invece dell’espressione di proteine fuse a mCherry, la variante BRCA1-C61G risulta leggermente più espressa rispetto a BRCA1 wild-type. Le altre varianti fuse con mCherry vengono espresse allo stesso livello della wild-type.
Per determinare l’effetto di BRCA1 e delle varianti missenso sulla ricombinazione omologa indotta, le cellule sono state inoculate per 24 ore in terreno di crescita, trasferite in terreno contenente galattosio (che induce l’espressione della proteina) per 17 ore in presenza di MMS. In seguito le cellule sono state piastrate in terreno sia completo che selettivo per determinare la sopravvivenza e il numero di ricombinanti. I risultati finora ottenuti indicano che i ceppi BRCA1 sono più sensibili all’MMS e che l’MMS induce meno eventi di ricombinazione nei ceppi che esprimono le varianti patogenetiche.
Per valutare l’effetto dell’MMS sulla localizzazione di BRCA1 abbiamo espresso nelle cellule di lievito BRCA1 wild-type o le sue varianti missenso come proteine di fusione con mCherry. Quindi ci siamo chiesti se ci fossero differenze nella localizzazione tra varianti neutre e patogenetiche, e se il danno al DNA potesse influenzare la loro localizzazione.
I nostri risultati dimostrano che BRCA1 si localizza nel nucleo. BRCA1 si localizza in due modi differenti; una localizzazione più diffusa ed una sottoforma di focus.
In particolare, nel ceppo che esprime BRCA1 wild-type o le varianti neutre K45Q e R1751Q, il numero delle cellule con foci nucleari aumenta significativamente.
I risultati dimostrano quindi che BRCA1 influenza la ricombinazione indotta dal MMS in lievito; ciò potrebbe indicare che BRCA1 interferisca con la riparazione del DNA in lievito.
In conclusione, il lievito Saccharomyces cerevisiae si riconferma essere un efficace sistema genetico per la approfondire i meccanismi che stanno alla base dell’insorgenza dei tumori.