• strati della corteccia
• Satb2
• Ctip2
• BMP inhibition
• inibizione di BMP
• Wnt inhibition
• inibizione di Wnt
• smoothened agonist
• cyclopamine
• ciclopamina
• mimosine
• mimosina
• patterning
• regionalizzazione
• cell cultures
• colture cellulari
• differentiation of the nervous system
• differenziamento del sistema nervoso
• neural induction
• induzione neurale
• cortical layers

Con il mio lavoro di tesi ho messo a punto un protocollo di neuralizzazione in vitro di cellule staminali embrionali (Embryonic Stem Cells, ESCs) di topo che consente di dirigere il loro differenziamento terminale in cellule della corteccia cerebrale.
Il protocollo che ho utilizzato consiste di una fase di produzione di strutture sferiche composte da numerose cellule chiamate corpi embrioidi (Embryoid Bodies, EBs), seguite da due fasi successive di coltura in adesione su un substrato di poliornitina e laminina. Grazie all’utilizzo di un mezzo di coltura minimo chimicamente controllato (Chemically Defined Minimal Medium, CDMM) è stato possibile ottenere e caratterizzare una coltura di cellule neuronali di identità omogenea.
Questo protocollo di neuralizzazione permette inoltre l’applicazione di sostanze esogene alla coltura, che possono indurre le cellule a modificare il loro destino di differenziamento. Durante la neuralizzazione, le ESCs producono fattori di crescita autocrini e paracrini che ne possono influenzare il destino di differenziamento, come BMP (Bertacchi, et al., 2013). In particolare, nel mio lavoro ho studiato gli effetti dell’inibizione della segnalazione di Wnt, di cui vari tipi vengono prodotti dalle ESCs prima, durante e dopo la loro neuralizzazione in vitro, e la sua interazione con la segnalazione di BMP. Il mio obiettivo è stato quello di studiare la capacità delle ESCs di differenziare in cellule neuronali della corteccia cerebrale, in presenza di inibitori chimici delle vie di segnalazione molecolare di WNT, di BMP, o di entrambe.
I risultati degli esperimenti che ho condotto sono stati valutati analizzando l’espressione di combinazioni di geni marcatori del patterning antero-posteriore e dorso-ventrale di telencefalo, diencefalo e mesencefalo con tecniche di RT-PCR ed immunocitochimica. I risultati finora ottenuti hanno evidenziato che WNT prodotto endogenamente dalle ESCs inibisce un programma di differenziamento corticale. Questo risultato è simile a quanto ottenuto inibendo BMP endogeno, in accordo a dati già pubblicati (Bertacchi, et al., 2013), e la loro combinazione sembra essere additiva. Esperimenti di caratterizzazione dell'espressione di geni chiave dell'istogenesi corticale, come Satb2, sono tuttora in corso.
Ho inoltre condotto esperimenti per studiare quale fosse il ruolo del ciclo cellulare durante il differenziamento dei neuroni corticali. È riportato in letteratura, infatti, che durante la corticogenesi si osserva un progressivo aumento del ciclo cellulare e che esso correla con un cambiamento del destino di differenziamento dei precursori, ma quale sia la relazione tra i due eventi non è tutt’ora chiara.
Per studiare questo aspetto del differenziamento dei neuroni della corteccia, ho trattato le colture con molecole in grado di allungare o accorciare il ciclo cellulare, così da poter saggiare se questo parametro influisce sulla tipologia di neuroni corticali prodotti nelle piastre di coltura. Le molecole utilizzate durante questo studio sono state la Ciclopamina e lo Smoothened Agonist (SAG), in grado rispettivamente di inibire o attivare la via di segnalazione di Sonic Hedgehog (Shh), un potente mitogeno, e successivamente la Mimosina, un composto capace di inibire i complessi molecolari necessari per la transizione G1-S, allungando il ciclo cellulare.
Dagli esperimenti condotti risulta che Ctip2, marcatore di strati profondi della corteccia, e Satb2, marcatore di strati superficiali, sono sotto un controllo dipendente dal ciclo cellulare. Le colture in cui viene rallentato il ciclo cellulare producono una maggior proporzione di neuroni corticali Satb2 positivi, mentre nelle colture in cui il ciclo è accelerato sono presenti un maggior numero di neuroni positivi per Ctip2. Tuttavia resta ancora da chiarire quali siano i meccanismi molecolari responsabili di questo controllo.