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I glioblastomi sono un tipo di tumore cerebrale poco responsivo a tutti i trattamenti attualmente disponibili. Per questo motivo c’è necessità di sviluppare nuove terapie per questa patologia.
Durante l’internato di tesi ho testato una tossina batterica per il trattamento di glioblastoma nel topo.

La tossina utilizzata è il fattore citotossico necrotizzante 1 (CNF1), un’esotossina prodotta da un ceppo patogeno di Escherichia coli. CNF1 è una proteina monomerica, costituita da una porzione N-terminale che si lega alle cellule, una regione intermedia che media la traslocazione attraverso la membrana e un dominio C-terminale che possiede attività catalitica. Nel citosol la parte C-terminale catalizza la deammidazione di un residuo di glutammina delle Rho-GTPasi (RhoA, Rac1 e Cdc42), impedendo così la loro attività GTPasica e lasciandole in uno stato di costante attivazione.
Questo comporta l’inibizione della citodieresi con conseguente multinucleazione nelle cellule che hanno capacità di dividersi. Inoltre è stato osservato un effetto di aumento della plasticità nei neuroni trattati, in assenza di fenomeni neurotossici.

Sulla base di queste evidenze, si è deciso perciò di testare la tossina su un modello di glioma di topo, costituito dalla linea cellulare GL261. Questa è una linea di cellule di derivate da topi del ceppo C57Bl/6 in cui si è provocato l'insorgere di un astrocitoma tramite trattamenti con l'agente cancerogeno 3-metilcolantrene. Una delle loro caratteristiche è di poter essere iniettate nella corteccia di topi singenici del ceppo C57Bl/6 e dare origine a tumore senza necessità di indurre immunosoppressione.
Dapprima il CNF1 è stato testato in vitro su colture di cellule GL261. Le cellule così trattate risultavano multinucleate, smettevano di proliferare e quindi andavano incontro a degenerazione.
Quindi si è voluto verificare il tipo di morte cellulare cui esse vanno incontro. Circa il 65% delle cellule trattate con la tossina esprimono marker di necrosi tardiva 10 giorni dopo il trattamento, mentre si è potuta escludere la morte per apoptosi. Rimane aperta la possibilità di una morte per senescenza, suggerita anche dalla morfologia delle cellule trattate, che appaiono appiattite e con nucleo e nucleoli di dimensioni maggiori.

Inoltre si è ottenuto un modello in vivo mediante l'iniezione intracorticale di cellule di glioma murino della linea GL261 in topi singenici nell’area visiva primaria. In questi topi, dopo 5 giorni dall'iniezione delle cellule, è stato poi iniettato il CNF1 in concentrazione 80 mM nella medesima area cerebrale.
Nell’internato di tesi ho seguito il test di sopravvivenza di topi con glioma trattati con CNF1. La loro sopravvivenza risulta significativamente maggiore rispetto ai topi con glioma trattati con una soluzione veicolo (che muoiono circa dopo 28 giorni) e anche rispetto a topi con glioma trattati con farmaci chemioterapici classici, come il temozolomide. In effetti circa metà dei topi trattati con CNF1 è sopravvissuta per almeno 60 giorni dopo il trapianto delle cellule.
Quindi ho partecipato all’analisi elettrofisiologica dell’attività corticale in un’area circostante l'iniezione delle cellule tumorali, per evidenziare differenze fra topi trattati con CNF1 e soluzione veicolo, dopo 21 giorni dall'iniezione delle cellule. L’analisi elettrofisiologica è stata eseguita tramite esperimenti acuti di inserimento di elettrodi extracellulari nella corteccia cerebrale, in cui si sono misurati i potenziali evocati da stimoli visivi (VEP). Le analisi quantitative di questi esperimenti sono tutt’ora in corso.
Nei topi registrati, ho poi misurato anche il volume totale del tumore. I dati preliminari, su 6 topi di controllo e 6 topi trattati con CNF1, indicano una riduzione nel volume del tumore in seguito al trattamento con CNF1.
Sto anche assistendo alla realizzazione di impianti cronici di elettrodi extracellulari nella corteccia visiva dei topi iniettati con le cellule GL261, al fine di seguire variazioni dei VEP nel corso dello sviluppo del tumore.
Ho lavorato anche su due sistemi per analizzare modifiche strutturali (come le spine dendritiche) nei neuroni circostanti il tumore: la colorazione di Golgi e l'utilizzo di topi con neuroni marcati con GFP.

In conclusione, i risultati ottenuti suggeriscono un effetto positivo del CNF1 sulla sopravvivenza di topi affetti da glioma e una riduzione di volume della massa tumorale, che rende questa tossina un possibile candidato nella terapia per i tumori del sistema nervoso centrale.