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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-09272004-172057


Tipo di tesi
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Autore
Casini, Paola
URN
etd-09272004-172057
Titolo
Ruolo di Hoxa2 nello sviluppo del sistema precerebellare del topo (Mus musculus)
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Relatori
relatore Prof. Pasqualetti, Massimo
Parole chiave
  • geni omeotici
  • sistema precerebellare
  • knockin
  • Hoxa2
  • nucleo pontino
Data inizio appello
12/10/2004
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
12/10/2044
Riassunto
La comprensione delle basi molecolari che controllano lo sviluppo del cervello costituisce un elemento chiave dello studio della neurobiologia. Lo sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC) è un processo complesso che consiste nella specificazione di molteplici tipi neuronali distinti e nella formazione di circuiti funzionali che controllano le attività vitali e comportamentali di un organismo adulto. La porzione posteriore del cervello, che comprende il cervelletto, il ponte ed il midollo allungato, presenta nuclei e circuiti neuronali importanti per l’integrazione delle funzioni sensoriali e motorie. Queste strutture derivano embriologicamente dal rombencefalo che, a stadi precoci di sviluppo, è transitoriamente segmentato lungo l’asse antero-posteriore (A-P) in una serie di compartimenti denominati rombomeri (r). Ciascun rombomero presenta distinte caratteristiche molecolari e dà origine a popolazioni specifiche di neuroni. I fattori di trascrizione appartenenti alla famiglia dei geni Hox sono presenti secondo uno specifico codice di espressione noto come “codice Hox”. L’alterazione di questo codice, ottenuta mediante l’impiego di tecniche di ricombinazione omologa nel topo (knockout genico), ha dimostrato un ruolo precoce dei geni Hox nel conferire l’identità neuronale lungo l’asse A-P del tubo neurale. In particolare, una corretta espressione di Hoxa2, che si estende rostralmente fino al rombomero 2, è necessaria per il normale sviluppo del rombencefalo anteriore.
L’impiego di una linea “knockin” in cui la regione codificante del gene Hoxa2 è stata sostituita con quella del gene “reporter” LacZ (Hoxa2-EGFP), ha mostrato che l’espressione di Hoxa2 è presente durante lo sviluppo fetale e persiste fino a stadi post-natali a livello dei nuclei del sistema precerebellare (nucleo pontino e nucleo dell’oliva inferiore). I precursori di questi nuclei, che originano nella porzione dorsale del tubo neurale, raggiungono la loro destinazione finale in seguito ad un esteso processo di migrazione dorso-ventrale (D-V) e successivamente i neuroni precerebellari danno origine alle proiezioni assonali che costituiranno le fibre muscoidi e. rampicanti Questa osservazione ha permesso di ipotizzare che Hoxa2 possa avere un ruolo tardivo nello sviluppo del SNC.
Durante il periodo del mio internato di tesi ho studiato lo sviluppo del sistema precerebellare nei topi mutanti per il gene Hoxa2 utilizzando la linea “knockin” Hoxa2-?LacZ che presenta il gene “reporter” LacZ nelle cellule che esprimono Hoxa2. Ho effettuato esperimenti di colorazione LacZ che mi hanno permesso di mettere in evidenza i neuroni precerebellari su preparati di encefalo ottenuti da embrioni eterozigoti (+/-) e mutanti (-/-) a vari stadi di sviluppo (E15.5 - P0.5). Il confronto dei risultati ottenuti ha evidenziato un’alterazione a carico della migrazione ventrale dei neuroni del nucleo pontino che negli animali -/- presenta sia una riduzione del numero delle cellule che lo compongono sia una marcata estensione lungo l’asse rostro caudale. Questo dato è stato confermato mediante l’analisi dell’espressione di marcatori molecolari specifici per i neuroni del nucleo pontino (Tag1 e Rig1), implicati nei meccanismi di migrazione, che mostrano un profilo di espressione alterato negli embrioni Hoxa2 -/-. Successivamente ho condotto esperimenti di marcatura retrograda per visualizzare le proiezioni assonali dei nuclei precerebellari al cervelletto. Queste osservazioni hanno fornito l’evidenza di un alterato sviluppo delle fibre muscoidi in assenza di Hoxa2.
I dati ottenuti con il mio lavoro di tesi permettono di concludere che il gene Hoxa2 svolge un ruolo cruciale nello sviluppo del nucleo pontino. Inoltre, questi dati forniscono una delle prime evidenze del ruolo di un gene, appartenente alla famiglia Hox, nel controllo di meccanismi tardivi dello sviluppo del SNC quali la migrazione neuronale e l’accrescimento assonale.

ABSTRACT
Understanding the molecular processes underlying the brain development is an important issue in developmental neurobiology. Central nervous system development is a complex process that brings to the generation of distinct neuronal types and to the formation of the functional circuitry in the adult brain controlling the physiological functions and the behavioral activities. The hindbrain, that originates the cerebellum, pons and medulla, contains primary regulatory centres that integrate sensory and motor activity.
The early hindbrain is transiently segmented into a series of transverse neuromeric bulges named rhombomeres. Each rhombomere presents distinct molecular features and originates to specific neuronal populations. The transcription factors belonging to the Hox family are expressed in a rhombomere-specific pattern giving rise to a distinct Hox code in each segment. The disruption of the normal Hox code by means of gene target inactivation (knockout) in mice has shown an early role for this class of genes in determining the neuronal identity along the antero-posterior axis. In particular, expression of Hoxa2 , normally present up to the boundary between r2 and r1, is crucial in early developmental patterning of the anterior hindbrain.
In the knockin line Hoxa2/ EGFP, the reporter gene shows that Hoxa2 expression, present during fetal development, persists until later developmental stages in the precerebellar system (pontine nucleus and inferior oliva). The precursor cells of these neurons originate from the dorsal neural tube and take specific long-distance migratory routes to reach their location on the ventral hindbrain. Subsequently they project mossy and climbing fiber axons to cerebellum. This data suggest that Hoxa2 may have a late role in CNS development.
In have focused my study in comparing the precerebellar system development of mutant Hoxa2-/- and heterozygote Hoxa2+/- mice, using a knock-in line (Hoxa2/?LacZ) in which the reporter LacZ replaces Hoxa2. Whole brain LacZ labeling, from E15.5 to P0, evidentiate altered pontine features and disorganized migratory streams. These data were confirmed by in situ hybridization with pontine nucleus specific markers, TAG-1 and Rig-1 that are also implicated in migration processes. To analyze the ponto-cerebellar projections I made retrograde labeling experiments: the data show altered mossy fibers in the Hoxa2-/-.
So I can conclude that Hoxa2 expression is crucial in the development of the pontine nucleus. Furthermore this data support evidence of a role, played by a Hox gene, in the control of late developmental mechanisms like neuronal migration and axonal outgrowth.
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