• Chromatin ImmunoPrecipitation.
• De-regolazione dell'espressione genica
• Coesina
• Sindrome di Cornelia de Lange

La sindrome di Cornelia de Lange (CdLS) è una condizione patologica che colpisce un neonato ogni diecimila. I soggetti affetti presentano tratti somatici tipicamente dismorfici e anomalie agli arti, in particolare quelli superiori; manifestano inoltre ritardo nello sviluppo e un deficit mentale più o meno marcato. Ad oggi sono stati identificati tre geni responsabili della CdLS: NIPBL, SMC1A ed SMC3. Mutazioni in NIPBL sono state identificate in circa il 60% dei casi, in SMC1A in circa il 5% mentre un solo probando porta la mutazione in SMC3. I geni citati codificano per proteine che fanno parte del complesso proteico della coesina o per fattori regolatori della coesina stessa. Infatti, il core della coesina è costituito da due proteine Structural Mainteinance of Chromosome (SMC, SMC1A ed SMC3) e due proteine non SMC, RAD21 e SA1/SA2. La proteina NIPBL invece è richiesta per il caricamento della coesina sulla cromatina. Il ruolo canonico della coesina è quello di presiedere alla corretta coesione tra i cromatidi fratelli, e pertanto si è ritenuto inizialmente che alla base della CdLS ci fossero dei difetti di coesione dei cromatidi fratelli. Tuttavia l'analisi di metafasi di soggetti affetti non mostra alcuna anomalia.
Negli ultimi anni, numerose evidenze sperimentali suggeriscono che la coesina è in grado di svolgere anche un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica. Sembra infatti che la coesina possa svolgere la funzione di “isolatore” ostacolando l’interazione fisica tra il promotore e l’enhancer, impedendo così la formazione dell'apparato trascrizionale e l’avvio della trascrizione. Questo modello prevede che, per una corretta attività trascrizionale, la coesina venga rimossa o dislocata dalla cromatina, in modo che il loop originatosi consenta la giustapposizione di promotore ed enhancer. A supporto di tale modello vi sono alcuni dati sperimentali. Mutazioni nei geni della coesina conferiscono al complesso una maggiore affinità di legame al DNA rispetto alle proteine wild type, e pazienti CdLS mostrano un profilo di espressione genica alterato.
Scopo di questa tesi è di investigare se mutazioni nei geni della coesina influenzano l’accessibilità della RNA polimerasi II (RNA pol II) alle regioni regolatorie. Esperimenti di sequenziamento della cromatina immunoprecipitata (ChIP-seq) eseguiti, attraverso una collaborazione scientifica, presso il laboratorio di Richard Young (Massachusetts Institute of Technology, Boston) hanno permesso di identificare sia le regioni del genoma in cui la coesina e i suoi regolatori vengono caricate co-localizzandosi con la RNA pol II, sia quelle in cui la coesina non si lega. Correlando questi dati con quelli pubblicati derivanti dall'utilizzo di microarray di espressione in cellule CdLS, sono state selezionate cinque categorie di regioni: 1) contenenti geni housekeeping, 2) contenenti geni cellula-specifici, 3) contenenti geni in cui l'arricchimento della coesina è maggiore, 4) regioni contenenti geni non legati dalla coesina, 5) regioni di deserto genico. Linee linfoblastoidi di pazienti CdLS e di soggetti sani, usate come controllo, sono state sottoposte ad immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) al fine di ottenere un arricchimento in sequenze legate dalla RNA pol II, e sono state successivamente analizzate per le categorie di regioni precedentemente descritte tramite Real Time PCR.
I risultati ottenuti mostrano una riduzione del reclutamento della RNA pol II alle regioni occupate dalla coesina nelle linee CdLS rispetto a quelle di controllo, portando nuove evidenze sperimentali a supporto dell'ipotesi che alla base della CdLS vi sia una de-regolazione della trascrizione genica.