• splint ligation
• aptameri
• oligonucleotidi
• sintesi
• biosensori
• selex

Negli ultimi anni l'impiego degli aptameri in alternativa agli anticorpi ha avuto un largo sviluppo, un'interessante applicazione è costituita dal loro uso come biorecettori con finalità analitiche e diagnostiche e per la realizzazione di biosensori. Questo lavoro di tesi si inserisce nell'ambito di un progetto finanziato dalla Comunità Europea per lo sviluppo di un biosensore per applicazioni biomediche mirate al riconoscimento simultaneo di vari analiti. La scelta di selezionare aptameri in grado di riconoscere e legare la Mieloperossidasi (MPO) è dovuta al grande valore diagnostico di questo enzima.
La MPO è un'emoproteina espressa dai neutrofili polimorfonucleati che ha una significativa azione pro-infiammatoria e può contribuire direttamente al danno tissutale; è un enzima presente in tre isoforme di lunghezza simile (attorno a 700 amminoacidi) che derivano dallo splicing alternativo del gene che le codifica.
Si è deciso di selezionare aptameri contro un bersaglio così complesso per via di due fattori principali:
1)l'emergente importanza diagnostica della proteina nel settore infiammatorio e cardiovascolare, livelli plasmatici elevati di questa possono infatti predire precocemente il rischio di infarto miocardico e di avversi eventi cardiaci maggiori da 1 a 6 mesi dopo la loro rilevazione (secondo uno studio condotto alla Cleveland Clinic Foundation);
2)la volontà di produrre un protocollo di evoluzione "in vitro" delle specie che rappresenti un modello generale applicabile a qualsiasi bersaglio proteico, prescindendo dalla reperibilità della proteina intera a livello commerciale.
La specifica applicazione dell'aptamero prevede la sua immobilizzazione su un supporto solido e, una volta immobilizzato, che questo debba essere in grado di riconoscere la molecola bersaglio. Parallelamente alla selezione di oligonucleotidi in grado di legare la proteina MPO è stata quindi messa a punto anche una metodica per l'ottenimento, per via enzimatica, di sequenze oligonucleotidiche in grado di essere immobilizzate e coniugate con altre molecole. Per quanto concerne il processo di evoluzione/selezione "in vitro" delle specie con maggiore affinità per la MPO, sono state messe a punto le fasi relative alla preparazione della collezione combinatoria: amplificazione e trascrizione delle sequenze di RNA da selezionare, separazione tra le sequenze che legano la molecola bersaglio e quelle che non hanno affinità per essa. Particolare attenzione è stata necessariamente rivolta alla messa a punto delle condizioni migliori per l'amplificazione delle sequenze per la PCR. Sono stati ottimizzati infatti il numero di cicli, le temperature di appaiamento ed estensione, la concentrazione dei primers e quella degli ioni magnesio.
Contemporaneamente con i cicli di selezione "in vitro", è stato messo a punto un metodo per "ancorare" le sequenze di RNA, ottenute mediante trascrizione, ad un supporto solido tramite l'addizione di una porzione oligonucleotidica. Questa tecnica, denominata splint ligation, prevede la ligazione enzimatica tra la sequenza di RNA e la molecola definita linker che termina con un gruppo amminico alifatico primario, necessario per l'immobilizzazione o la marcatura. Per promuovere tale reazione le estremità delle due molecole sono poste in contatto grazie ad una terza molecola detta splint, la quale è complementare per una parte all'estremità del trascritto e per l'altra al linker. Si forma così un complesso che porta le estremità nella posizione ottimale per la ligazione enzimatica. Questa metodica è stata messa a punto facendo uso di un trascritto modello (TSH) e sono state studiate e sintetizzate le sequenze per l'applicazione del metodo alla collezione utilizzata per la selezione "in vitro".