• strategia di vaccinazione

Nello studio di un vaccino contro virus patogeni per l’uomo è necessario l’impiego di modelli animali adeguati per testare nuove strategie di vaccinazione e valutarne l’efficacia protettiva in vivo.
Uno dei modelli animali che si sono rivelati utili per chiarire i meccanismi patogenetici indotti dal virus dell’HIV e sviluppare nuovi approcci terapeutici e vaccinali è l’infezione da virus dell’immunodeficienza felina (FIV) nel suo ospite naturale.
FIV infatti è un lentivirus che causa nel gatto un’infezione con notevoli somiglianze dal punto di vista clinico e immunopatogenetico con la malattia da HIV nell’uomo ed è pertanto attualmente utilizzato quale modello di studio per lo sviluppo di vaccini. In questo ambito è in corso di allestimento un progetto di vaccinazione per FIV basato su un protocollo di tipo prime-boost.
La prima fase consiste in un priming a DNA ed utilizza un plasmide esprimente Env di FIV in combinazione con una citochina, il granulocyte macrophage colony stimulating factor felino (fGM CSF), che stimola la proliferazione ed il differenziamento di cellule dendritiche, specializzate nella presentazione dell’antigene agli effettori della risposta immune.
Il boost successivo al priming è invece costituito da linfociti autologhi che esprimono Env sulla superficie cellulare, insieme ad un altro immunostimolante, l’interferon gamma felino, utilizzato al fine di reclutare in vivo gli effettori della risposta immunitaria e potenziare quella cellulo mediata verso l’antigene virale. Quest’ultimo punto verrà realizzato mediante trasduzione in vitro dei linfociti attraverso l’impiego di un vettore FIV-derivato replicazione difettivo. I linfociti verranno poi reinfusi negli animali precedentemente sottoposti ad immunizzazione mediante priming.
Scopo della tesi è la realizzazione di sistemi di veicolazione degli immunogeni (delivery) utilizzati per il priming ed il boost. Questo obiettivo prevede l’ingegnerizzazione dei vari costrutti molecolari e la valutazione della loro efficienza di delivery. La funzionalità del costrutto di priming è stata valutata mediante saggi allestiti per valutare l’attività biologica del fGM-CSF e l’espressione di Env nelle cellule trasfettate.
Per la fase di boost sono stati prodotte e caratterizzate diverse versioni del vettore FIV-derivato, con l’obbiettivo di ottimizzare il sistema di trasduzione. Per la produzione del vettore è stata utilizzata una strategia a due plasmidi, un costrutto di packaging che esprime le proteine strutturali Gag ed enzimatiche, ed un costrutto codificante Env ed il fIFNg. Nei saggi effettuati in vitro sono stati utilizzati dei costrutti vettore prototipo, contenenti il gene reporter green fluorescent protein (GFP) al posto dell’fIFN-gamma, che ci ha permesso di valutare l’efficienza di veicolazione mediante lettura in citofluorimetria a flusso delle cellule GFP-positive. Le diverse versioni del vettore sono state testate per efficienza di trasduzione su linee di fibroblasti e linfoblasti felini, avvalendosi anche dell’uso di due diverse strategie per la concentrazione delle particelle virali. È stata valutata anche l’espressione di Env da parte dei costrutti, attraverso un Western Blot su cellule trasfettate e trasdotte, apportando le opportune modifiche al costrutto vettore per ottenere un’espressione adeguata della proteina.