• Agrobacterium tumefaciens
• acido rosmarinico
• Salvia

Il genere Salvia appartiene alla famiglia delle Lamiaceae ed è particolarmente ricco di specie sia annuali che perenni, circa 1000 (Marchev et al., 2014), usate sia per scopi alimentari o terapeutici che semplicemente ornamentali. La Salvia officinalis è una delle piante aromatiche più conosciute ed utilizzate nel genere Salvia. Un’ampia biodiversità di piante appartenenti al genere Salvia mostra elevata varietà in termini di composti ad attività biologica. Le sue proprietà sono sia aromatiche date dall' olio essenziale che ha una composizione chimica molto complessa, sia antisettiche, antibatteriche, stimolanti, digestive, cicatrizzanti, toniche del sistema nervoso, antisudorifere, ipoglicemizzanti (Kintzios, 2005). Un metabolita importante del genere Salvia è l’acido rosmarinico, che include molte attività sopracitate. Gli enzimi della via metabolica di sintesi dell’acido rosmarinico sono stati ampiamente studiati e in un precedente lavoro (Barberini et al., 2013) è stato clonato e sequenziato il gene HPPR (idrossifenilpiruvato riduttasi) in Salvia officinalis. Questo rappresenta il primo enzima specifico della biosintesi dell’acido rosmarinico dato che il suo substrato, il 4-idrossifenilpiruvato, costituisce un punto di ramificazione per altri pathways metabolici.
In questo lavoro di tesi sono state impiegate due specie Salvia, S. dolomitica L. e S. officinalis L. per la produzione di colture in vitro (germogli, calli, colture in sospensione), successivamente colture cellulari sono state impiegate e trasformate geneticamente in chiave di “molecular pharming” per la produzione di metaboliti d'interesse (acido rosmarinico) sfruttando il gene HPPR.
L’efficienza di trasformazione delle piante aromatiche è generalmente molto bassa (Bennet et al., 1994), quindi la trasformazione genica è stata mediata da diversi strains di Agrobacterium tumefaciens, che contenevano il gene della GFP (green fluorescent protein) o quello HPPR (idrossifenilpiruvato reduttasi), per valutare l'efficienza e scalabilità di questi sistemi.
Sono stati utilizzati tre metodi diversi di trasformazione (metodo A, B, C) che differiscono per le diverse concentrazioni di inoculo utilizzato. Il metodo A prevede l’utilizzo dell’inoculo tal quale, il metodo B prevede una diluizione dell’inoculo previa centrifuga, il metodo C prevede una iniezione diretta in callo dell’inoculo diluito.
L’efficienza di trasformazione è molto variabile a seconda del ceppo utilizzato e del costrutto utilizzato (GFP o HPPR). La valutazione della quantità di acido rosmarinico prodotta dalle cellule trasformate darà un ulteriore indicazione dell’efficacia dell’inserimento del gene HPPR nelle sospensioni cellulari di Salvia.