• proteinchinasi
• plasticità sinaptica
• pompa elettrogenica

La pompa Na+/K+-ATPasi è la principale componente responsabile della genesi dell’iperpolarizzazione postuma (o afterhyperpolarization, AHP) che accompagna la scarica dei potenziali d’azione nei neuroni sensoriali tattili (cellule T) della sanguisuga Hirudo medicinalis (Baylor & Nicholls, 1969a; Jansen & Nicholls, 1973). In queste cellule, la AHP può essere indotta o in seguito a stimolazione dei campi recettoriali o mediante iniezione intracellulare di corrente depolarizzante.
Il ruolo fisiologico della AHP è quello di creare dei blocchi di conduzione nella trasmissione dei segnali elettrici a livello dei punti di diramazione assonale dove i processi neuritici di calibro maggiore si diramano in quelli di calibro minore (branching points) (Baylor & Nicholls, 1969b; Van Essen, 1973; Yau, 1976; Cataldo et al., 2005).
Negli ultimi anni, è stato messo in evidenza che la AHP può essere modulata in ampiezza sia in senso positivo che negativo e l’entità di tale modulazione è determinata da modificazioni nell’attività della pompa Na+/K+-ATPasi. In particolare, è stato osservato che il neurotrasmettitore endogeno serotonina (5HT), via adenosin monofosfato ciclico (cAMP), riduce l’ampiezza della AHP attraverso l’inibizione dell’attivazione fasica della Na+/K+-ATPasi indotta dalla scarica sostenuta di potenziali d’azione che genera la AHP stessa. Inoltre, la 5HT è in grado di inibire la pompa di membrana anche quando la sua attività è stimolata tonicamente durante l’iniezione intracellulare di ioni Na+ (Belardetti et al., 1984; Catarsi & Brunelli, 1991; Catarsi et al., 1993). La stimolazione intracellulare ripetuta ad intervalli costanti di tempo provoca, invece, un progressivo incremento dell’ampiezza della AHP sostenuto da un potenziamento dell’attività fasica della Na+/K+-ATPasi (Scuri et al., 2002) determinato da una cascata intracellulare innescata dal Ca2+ che coinvolge i metaboliti della via 5-lipoossigenasica dell’acido arachidonico (AA) (Scuri et al., 2005).
Nelle cellule T, quindi, l’ampiezza della AHP rappresenta un buon parametro per monitorare l’attività della Na+/K+-ATPasi con un approccio di tipo elettrofisiologico.
Inoltre, analizzando l’entità della connessione sinaptica tra una cellula T e un suo neurone follower è stato evidenziato che la modulazione dell’ampiezza della AHP determina una modulazione della forza sinaptica tra le due cellule (Scuri et al., 2002; Scuri et al., submitted). Queste osservazioni suggeriscono che l’attività della pompa elettrogenica è coinvolta in fenomeni di plasticità sinaptica.
In questa tesi, è stato analizzato l’eventuale ruolo delle protein chinasi A (PKA) e delle protein chinasi C (PKC) nella modulazione dell’attività tonica e fasica della Na+/K+-ATPasi.
Dai nostri risultati è emerso che le PKA svolgono un’azione inibitoria sull’attività tonica e un’azione facilitante sull’attività fasica dell’enzima di membrana. Sono stati condotti esperimenti di iniezione intracellulare di Na+ dopo aver preincubato le cellule con diversi inibitori delle PKA. In queste condizioni sperimentali, l’iniezione di Na+ ha determinato un’iperpolarizzazione del potenziale di membrana (Vm) significativamente maggiore rispetto ai controlli (cellule trattate con soluzione fisiologica). Questo risultato mette in evidenza che l’inibizione delle PKA provoca un potenziamento dell’attività tonica della Na+/K+-ATPasi, suggerendo che le PKA inibiscono l’attività tonica della pompa. Tra i diversi inibitori utilizzati, l’Rp-8-Br-cAMPS è risultato essere l’inibitore con maggiore efficacia. Questa sostanza è stata utilizzata anche in esperimenti in cui l’iniezione di Na+ avveniva dopo preincubazione con l’inibitore delle PKA e successivo trattamento con 5HT o 8-Br-cAMP (analogo permeabile del cAMP). Tali esperimenti sono stati condotti al fine di chiarire se l’azione inibitoria da parte della 5HT sulla pompa elettrogenica si esplicasse attraverso l’attivazione delle PKA. È stato osservato che, anche in presenza dell’inibitore Rp-8-Br-cAMPS, la 5HT e l’analogo del cAMP sono in grado di esercitare i loro effetti inibitori sull’enzima di membrana, suggerendo che 5HT e cAMP esplicano il loro effetto modulatorio sulla pompa senza attivazione delle PKA.
Inoltre, in neuroni T trattati con Rp-8-Br-cAMPS l’ampiezza della AHP è risultata essere ridotta rispetto a quella misurata in soluzione fisiologica. Questo dato suggerisce che le PKA esercitano una modulazione positiva sull’attività fasica della Na+/K+-ATPasi: infatti, quando inibite, l’attività fasica della pompa elettrogenica risulta ridotta.
Infine, utilizzando l’inibitore delle PKC cheleritrina, è stato evidenziato che questa famiglia di protein chinasi ha un’azione facilitante sull’attività tonica e un’azione inibitoria sull’attività fasica della Na+/K+-ATPasi. In cellule T trattate con cheleritrina, la depolarizzazione del Vm che si ha durante l’iniezione intracellulare di Na+ indica che la pompa elettrogenica è inibita e quindi, che le PKC modulano positivamente l’attività tonica dell’enzima. In cellule sottoposte ad un protocollo di stimolazione ripetuta ad intervalli costanti di tempo, dopo trattamento con cheleritrina, il progressivo incremento dell’ampiezza della AHP è risultato significativamente maggiore rispetto a quello ottenuto in soluzione fisiologica. Ciò suggerisce che le PKC esercitano una modulazione negativa sull’attività fasica della Na+/K+-ATPasi.