• baculovirus
• p300
• acetilazione
• integrasi
• HIV-1

L’ integrazione del cDNA di HIV-1 nel genoma cellulare è un passaggio fondamentale nel ciclo vitale del virus, infatti, in assenza di tale evento, il virus non è in grado di portare a termine il ciclo replicativo. L’ integrazione provirale è catalizzata da una proteina codificata dallo stesso virus e denominata integrasi (IN).
Numerosi studi finalizzati all’ individuazione di siti specifici di integrazione hanno dimostrato che non esitono sequenze di riconoscimento per l’ integrazione virale. Tuttavia, grazie ai metodi di indagine ad ampio spettro sviluppati nell’ era post-genomica, è stato possibile mettere in luce che in realtà l’integrazione virale non è del tutto casuale ma avverrebbe preferenzialmente in regioni del genoma trascrizionalmente attive, dove la cromatina assume una conformazione di tipo “aperta”.
Alla luce di questi risultati è stato ipotizzato che proteine in grado di modificare la struttura della cromatina potrebbero interagire con HIV-1 durante il fenomeno integrativo. La famiglia di proteine note come “acetiltransferasi” è in grado di determinare il rilassamento della cromatina tramite acetilazione degli istoni e conseguente attivazione trascrizionale.
A questo gruppo di proteine appartiene p300. Il primo obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di produrre la proteina ricombinante p300 per compiere studi in vitro di interazione con IN di HIV-1. A questo fine è stato utilizzato il sistema “Baculovirus Expression Vector System” (BEVS) che prevede l’utilizzo di cellule di insetto (Spodoptera Frugiperda) per la produzione di proteine ricombinanti ad alte concentrazioni e successiva purificazione tramite cromatografia per affinità. Questo sistema di purificazione presenta notevoli vantaggi rispetto ai sistemi standard di purificazione in batteri, in quanto consente di produrre proteine ricombinanti con caratteristiche biologiche simili alle proteine native eucariotiche.
Una volta prodotta, p300 ricombinante, la cui funzionalità è stata verificata tramite saggi di acetilazione, è stata utilizzata per studiare la sua attività su IN.
I risultati ottenuti ci hanno permesso di concludere che p300 acetila e lega l’integrasi in vitro e che l’interazione tra le due proteine determina un aumento dell’attività catalitica di IN in vitro.
In conclusione è stato messo a punto un sistema di purificazione che ha permesso di svolgere studi in vitro di interazione tra una proteina cellulare, p300, e una virale, IN.