• central action
• Botulinum neurotoxins
• BoNT/A
• retrograde axonal transport

Le tossine clostridiali sono potenti neurotossine, che comprendono la tossina tetanica TeNT, che causa il tetano, e le tossine botuliniche (BoNT/s) che causano il botulino. Questi due stati patologici sono caratterizzati rispettivamente da una paralisi spastica per blocco dei circuiti inibitori a livello di midollo spinale e da una paralisi flaccida per blocco del rilascio di acetilcolina a livello della giunzione neuromuscolare.
Tramite internalizzazione per endocitosi nel neurone e successiva traslocazione nel citosol, le tossine clostridiali esercitano la loro attività metalloproteasica contro le componenti del complesso SNARE, fondamentali per il meccanismo di fusione delle vescicole sinaptiche. Il taglio delle proteine SNARE provoca di fatto un blocco del rilascio di neurotrasmettitore.
La tossina botulinica di tipo A (BoNT/A) ha effetti di notevole durata a livello della giunzione neuromuscolare, con un’azione transiente e un blocco reversibile. Per questo viene largamente utilizzata non solo nella cosmetica, ma anche nel trattamento clinico di iperfunzionalità dei terminali colinergici come spasticità e distonie o per trattamenti di forme di dolore cronico.
I benefici clinici persistenti del trattamento con BoNT/A anche dopo il termine della sua attività, hanno fatto pensare ad un coinvolgimento dei sistemi centrali. Tali effetti potrebbero essere dovuti ad un’azione diretta o indiretta della tossina. Dati sperimentali dimostrano che la tossina può essere trasportata lungo l’assone dei motoneuroni, tramite un processo di trasporto retrogrado, suggerendo così un’azione diretta.
Nel mio lavoro di tesi ho investigato se la tossina fosse in grado di effettuare transcitosi, chiarendo alcuni aspetti dell’azione a livello centrale dopo trattamento periferico.
Dopo aver iniettato BoNT/A nella regione facciale dei baffi (whisker-pad), tramite tecniche di immunoistochimica, ho rilevato tracce di SNAP-25 tagliata (SNAP/A) a livello del nucleus facialis del tronco encefalico. Si osserva una diversa cinetica della propagazione degli effetti della tossina tra ratto e topo, dove in quest’ultimo, è possibile osservare SNAP/A già dopo un giorno dall’iniezione. Nei 15 giorni successivi all’iniezione le quantità di SNAP/A rilevabili nei due animali sono paragonabili.
Per dimostrare se ad essere trasportata fosse la tossina attiva e non SNAP/A, ho effettuato il taglio del nervo faciale affinché venisse bloccato il trasporto assonale. A 12 giorni dal trattamento, a livello del nucleus facialis, gli animali iniettati con BoNT/A e sottoposti a taglio del nervo, mostrano livelli di SNAP/A paragonabili ai topi che non hanno subito assotomia. Ciò dimostra che la tossina viene trasportata nella sua forma cataliticamente attiva e in grado di effettuare il taglio.
Evidenze convincenti del fenomeno della transcitosi nel sistema centrale, sono state dimostrate con iniezioni intra-cerebro-ventricolari di un’antitossina a seguito di iniezione periferica di BoNT/A. L’antitossina capace di intercettare specificatamente BoNT/A nel trasferimento, permette di proteggere il sub-strato dal taglio. I dati che ho raccolto dimostrano una netta diminuzione di SNAP/A negli animali trattati con anti tossina rispetto ai controlli.
Infine, tramite analisi di colocalizzazione di segnali, ho determinato una preferenzialità dell’azione enzimatica sui terminali colinergici, dove si osserva anche un aumento delle dimensioni degli stessi terminali, dovuta all’accumulo delle vescicole sinaptiche incapaci di fondersi con la membrana presinaptica. L’identificazione e colocalizzazione dei terminali colinergici tramite immunoistochimica per SNAP/A il trasportatore vescicolare dell’acetilcolina (VAChT), ha dimostrato tale preferenzialità, sostenuta anche dal fatto che a livello di neuropilo i terminali VAChT-positivi sono meno abbondanti, rispetto ai VGLUT2- o VGAT-positivi (rispettivamente, trasportatore vescicolare del glutammato e trasportatore vescicolare del GABA).

Clostridial toxins are the most potent neurotoxins known. They include tetanus toxin (TeNT), that causes tetanus, and botulinum toxins (BoNT/s) that cause botulism. These two pathological conditions are characterized respectively by a spastic paralysis due to blockage of spinal cord inhibitory circuits, and a flaccid paralysis due to interference with acetylcholine release at the level of the neuromuscular junction.
Following endocytosis into the neuron and subsequent translocation in the cytosol, clostridial toxins exert their metalloproteasic activity against specific SNARE complex components, which are fundamental for the docking and fusion of synaptic vesicles. The cleavage of SNARE proteins indeed causes an arrest of neurotransmitter release.
Botulinum toxin type A (BoNT/A) exerts a prolonged yet transient blockade of transmitter release at the neuromuscular junction. For this reason, it is widely used not only in cosmetics (for the removal of facial wrinkles) but also in the clinical treatment of pathologies characterized by hyperfunctionality of cholinergic terminals, such as spasticity and dystonia, and for treatment of chronic pain. The persistent clinical benefits of BoNT/A treatment even after the time window of neuromuscular blockade suggested the involvement of the central nervous system. Such central effects may be due to direct or indirect action of the toxin. Previous experimental data have demonstrated that BoNT/A can be trafficked along the axon of the motoneuron through a retrograde transport process, suggesting a direct central action of the toxin.
In my thesis, I investigated whether the toxin was able to undergo transcytosis, i.e. entry into second-order neurons afferent to the motoneurons after transport, and the potential selectivity of such process.
After injecting BoNT/A into the whisker-pad of rats and mice, using an immunohistochemical assay, I detected significant levels of cleaved SNAP-25 (SNAP/A) in the nucleus facialis of the brainstem, i.e. the area containing the motoneurons projecting to the whiskers. I observed a different kinetics in the retrograde propagation of toxin effects between rat and mouse. Specifically, retrograde spread was faster in mice, with SNAP/A being detectable already at one day after injection. At 15 days after the injection, levels of SNAP/A were roughly comparable between the two species.
To demonstrate whether the active toxin is transported (rather than the cleaved SNAP-25), I sectioned the facial nerve to block axonal transport. Accumulation of SNAP/A in the nucleus facialis was observed despite the axotomy, indicating transport of the the catalytically active BoNT/A.
To obtain compelling evidence for BoNT/A transcytosis, I performed intracerebroventricular injections of an antitoxin following peripheral injection of BoNT/A. The data showed a marked decrease in SNAP/A in animals treated with antitoxin compared to controls. Thus, the antitoxin was capable of specifically intercepting BoNT/A, demonstrating that the toxin physically leaves motoneurons to enter second-order neurons in the brainstem.
Finally, by double-label immunohistochemistry and signal colocalization analysis, I investigated the potential selectivity of transcytosis. I compared the presence of SNAP/A in cholinergic, GABAergic and glutamatergic synaptic inputs to motoneurons. I found a preferential localization of SNAP/A in the cholinergic terminals, accompanied by an increase in the size of the same terminals due to the accumulation of synaptic vesicles unable to fuse with the presynaptic membrane.
Altogether, these data these findings highlights cell-specific, direct central actions of BoNT/A which are important to fully understand its mechanisms of action and therapeutic effectiveness.