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• mTOR
• AMPK
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INTRODUZIONE: Il Morbo di Parkinson (PD) è il secondo disordine degenerativo più comune nei paesi industrializzati, affligge l’1% della popolazione dopo i 60 anni. I sintomi relativi al Parkinson sono dovuti principalmente ad una drastica diminuzione della dopamina (DA) a livello di alcune strutture del sistema extrapiramidale (sostanza nera, striato) e all’accumulo dei corpi intracitoplasmatici di Lewy, inclusioni che contengono α-sinenucleina e ubiquitina. La sostituzione della dopamina rappresenta quindi la miglior strategia terapeutica per alleviare la disabilità motoria parkinsoniana. La dopamina però non può essere somministrata come tale in quanto, a causa dell'elevata basicità non supera la barriera ematoencefalica. Al momento il precursore metabolico della dopamina, la L-Dopa (L-3,4- didroxifenil-ammina) rappresenta il principale farmaco antiparkinson. Tale farmaco non porta a guarigione ma allevia solo i sintomi caratteristici del Parkinson e per questo deve essere somministrata in modo continuo per tutta la vita del paziente. Tuttavia, questo produce severi effetti avversi che limitano il potere terapeutico del farmaco. Anche altre tipologie di farmaci, utilizzabili in questo contesto da soli o in associazione con L-Dopa, causano molti effetti avversi che ne limitano l’uso terapeutico o addirittura mostrano una inadeguata efficacia nelle disabilità motorie su parkinsoniani, specie negli stadi avanzati della malattia. Date tutte queste problematiche, tutt’oggi continua la ricerca di nuove terapie che limitino le complicazioni mantenendo la qualità terapeutica. A questo proposito, negli ultimi anni molti ricercatori hanno focalizzato il loro interesse sul possibile ruolo di SIRT1 nel Parkinson, evidenziando come non solo SIRT1, ma anche AMPK e mTOR (due proteine strettamente correlate a SIRT1) potrebbero avere ruolo protettivo verso la patologia, diminuendo la formazione di aggregati proteici anormali. In aggiunta, la relazione tra SIRT1 e Parkinson è stata confermata da molti studi su colture cellulari e modelli murini che hanno soprattutto mostrato un ruolo di SIRT1 nell’attivazione dell’heat shock factor 1 (HSF1), fattore coinvolto nella trascrizione degli chaperon molecolari, compreso HSP70, che regola l’omeostasi delle proteine cellulari, confermando la sua azione neuroprotettiva.
SCOPO: Nonostante la presenza di molti studi che ipotizzano un ruolo importante di SIRT1 nel Parkinson, sono necessari altri studi volti a confermare questi dati o a chiarire i target specifici con cui SIRT1 interagisce in questo contesto. Sulla base di queste premesse, questo progetto sperimentale si pone come scopo generale la valutazione dell’effetto di sostanze attivatrici di SIRT1 su modelli in vitro della suddetta patologia. In particolare, verrà valutato l’effetto di modulatori nutraceutici di SIRT1, in seguito a somministrazione singola o sinergica, sul pathway di SIRT1, AMPK e mTOR e sui livelli di α-sinucleina .
MATERIALI E METODI: Le linee cellulari utilizzate sono state i neuroni umani di neuroblastoma, SH-SY5Y. Le cellule sono state trattate con due polifenoli ed il rotenone, noto modello farmacologico della patologia. In dettaglio, l’ Acido Ferulico (25µM; 50µM) e il Tirosolo (10µM; 20µM) sono stati utilizzati sia singolarmente che in associazione, per un tempo di incubazione di 3,6 e 24 h; il Rotenone (20µM) è stato utilizzato per un tempo di incubazione di 12h in cellule SH-SY5Y opportunamente pre-trattate nelle 12 ore precedenti con i due polifenoli in esame. Nella prima fase dell’esperimento, le sostanze sono state testate per valutare la loro eventuale citotossicità a diverse concentrazioni e a diversi tempi di stimolazione, utilizzando il metodo fluorimetrico Cell Titer-Blue Viability Assay (Promega). I livelli di espressione di SIRT1 e l’attivazione/inibizione di AMPK e mTOR sono stati successivamente valutati mediante la tecnica del Western Blot, mentre i livelli di α-sinucleina sono stati quantificati mediante test Elisa.
RISULTATI: L’analisi dei dati ottenuti dai test di citotossicità, nel caso di Acido Ferulico e Tirosolo, ha messo in evidenza come non vi sia nessuna variazione significativa del numero di cellule vitali dei campioni trattati rispetto al controllo, ovvero rispetto alle cellule senza trattamento, dimostrando in questo modo la non tossicità delle sostanze. Al contrario, per quanto concerne il Rotenone, si osserva una diminuzione statisticamente significativa del numero di cellule vitali, evidenziando una tossicità della sostanze direttamente proporzionale alla concentrazione e al tempo di incubazione. Inoltre, i risultati dei nostri esperimenti evidenziano come l’espressione di SIRT1 sia significativamente aumentata in tutti i gruppi sperimentali rispetto al gruppo controllo, sia quando le cellule sono state trattate con sostanze singole sia in associazione (***p<0.001) In dettaglio, l’analisi dei risultati delle associazioni tra le sostanze (Acido Ferulico+Tirosolo) ha messo in evidenza come la loro somministrazione associata comporti un aumento dell’espressione di SIRT1 maggiore e statisticamente significativo rispetto a quello ottenuto sommando gli effetti delle singole somministrazioni, evidenziando quindi la presenza di un effetto sinergico tra le sostanze sull’espressione di SIRT1. In aggiunta, tutte e due le sostanze determinano un’attivazione di AMPK e un’inibizione di mTOR quando somministrate singolarmente. L’analisi dei campioni trattati con Rotenone e opportunamente pretrattati con i due polifenoli in esame, ha evidenziato come sia l’Acido Ferulico che il Tirosolo siano in grado di contrastare il danno dovuto al Rotenone. Infine, la valutazione dei livelli di α-sinucleina mediante test Elisa e, soprattutto la diminuzione dei livelli di questa proteina nei campioni trattati o pretrattati con Acido Ferulico e Tirosolo ha confermato l’importanza dei due polifenoli in questa patologia.
CONCLUSIONI: I risultati del presente lavoro di tesi evidenziano come i due polifenoli testati, Acido Ferulico e Tirosolo, non solo sono in grado di attivare SIRT1, ma sono in grado anche di attivare AMPK ed inibire mTOR. In aggiunta, la loro azione risulta fortemente positiva anche su campioni trattati con Rotenone e sulla determinazione dei livelli di α-sinucleina, che risulta, infatti, fortemente inibita da queste due sostanze. L’importanza di questi dati è avvalorata dal ruolo di tutte queste proteine nella malattia di Parkinson, confermando, infine, il potenziale ruolo neuroprotettivo di SIRT1 e l’importanza di un incremento dell’attività di SIRT1 come promettente strategia terapeutica coadiuvante all’L-Dopa.