• rifampicina
• 2°
• 2C
• suino
• citocromo P450
• beta-naftoflavone

Il sistema citocromo P450 (CYP) è una superfamiglia di enzimi che svolgono un ruolo fisiologico importante nel metabolismo di sostanze endogene ed esogene. Si tratta di enzimi di fase I presenti prevalentemente a livello epatico che si riscontrano, tuttavia, anche in molti tessuti extraepatici. L'espressione e l'attività di alcune isoforme di CYP possono essere indotte, o inibite, da molti xenobiotici, come ad esempio farmaci o inquinanti ambientali. La famiglia 2C è una delle più importanti tra i citocromi P450 essendo responsabile del metabolismo di una serie di substrati endogeni e di circa il 20% dei farmaci prescritti in clinica.
In questo lavoro di tesi è stato scelto il suino come modello sperimentale perché, sebbene negli ultimi anni sia stato proposto come modello animale per gli studi di farmacologia e tossicologia a causa della sua somiglianza anatomica e fisiologica con l'uomo, oltre che per le potenziali applicazioni cliniche, gli studi riguardanti gli enzimi metabolici effettuati su questo animale sono scarsi, sia a livello epatico che, ancor più, negli organi extraepatici.
È noto, da studi precedenti, che la rifampicina (un antibiotico della classe dei macrolidi) è in grado di indurre nell'uomo i CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 e il CYP2A6 tramite l'attivazione del recettore nucleare pregnane X receptor (PXR). Lo scopo principale di questa tesi è stato quello di caratterizzare l'espressione e l'inducibilità da rifampicina di vari membri della sottofamiglia 2C e del CYP2A19 (ortologo del CYP2A6 umano) nel fegato ed in vari tessuti extraepatici di suino. Inoltre, è stato valutato l'effetto del trattamento in vivo con β-naftoflavone sull'attività dei CYP2C e CYP2A19 nel fegato e nel rene di suino, poiché è noto che, nel ratto, il β-naftoflavone induce fortemente i CYP1A1 e CYP1B1 inibendo, per compensazione, gli altri citocromi P450 espressi ad alti livelli costitutivi (ad esempio i CYP2C).
Basandosi sulle sequenze geniche, parziali e complete, dei vari CYP2C di suino note in banca dati sono stati disegnati primer specifici per tre diverse isoforme (CYP2C33, CYP2C42 e CYP2C49). È stato estratto e retrotrascritto l'RNA totale proveniente da diversi tessuti prelevati da due suini di controllo e tre suini trattati in vivo con rifampicina. Con il cDNA ottenuto sono stati eseguiti esperimenti di amplificazione genica mediante PCR. Essi hanno dimostrato che queste tre isoforme di CYP2C sono espresse costitutivamente nel fegato, nel rene e nella mucosa nasale respiratoria di suino. Diversamente, nel polmone, nel cuore e nella corteccia cerebrale è stata rivelata l'espressione dei CYP2C33 e CYP2C49 ma non del CYP2C42. Tali esperimenti hanno inoltre evidenziato che l'espressione di queste isoforme è inducibile da rifampicina nel fegato e nel rene, ma non negli altri tessuti analizzati.
Un esperimento di Western blotting effettuato utilizzando anticorpi policlonali anti-CYP2C11 di ratto, su campioni di fegato e rene di suino, ha confermato anche a livello proteico l'induzione vista a livello trascrizionale in questi due organi, come effetto del trattamento con rifampicina.
A livello di attività enzimatica, i vari CYP2C sono stati investigati in microsomi di fegato e rene di suino utilizzando alcune attività marcatrici per i vari CYP2C umani: l'idrossilazione del paclitaxel per il CYP2C8, la 4-idrossilazione del diclofenac e l'idrossilazione della tolbutammide per il CYP2C9, ed infine la (S)-mefenitoina 4'-idrossilazione per il CYP2C19. Sono state eseguite, inoltre, in microsomi di fegato, prove di inibizione delle attività enzimatiche specifiche per i CYP2C umani, utilizzando tre inibitori selettivi (quercetina per il CYP2C8, sulfafenazolo per il CYP2C9 e pirene per il CYP2C19). I risultati ottenuti hanno mostrato che, mentre il trattamento con β-naftoflavone tende a diminuire tutte le attività prese in considerazione quando effettuate in microsomi di fegato, il trattamento con rifampicina ha significativamente aumentato le attività paclitaxel idrossilasi (in campioni di fegato) e tolbutamide idrossilasi (in campioni di fegato e rene). Inoltre, la quercetina ha inibito, a livello epatico, l'attività paclitaxel idrossilasi.
Per quanto riguarda il CYP2A19, ortologo suino del CYP2A6, esso è espresso costitutivamente in tutti gli organi di suino analizzati, ma è inducibile da rifampicina soltanto a livello epatico. Tuttavia, tale induzione a livello trascrizionale non si esplica in un aumento dell'attività enzimatica marcatrice cumarina 7-idrossilasi. Il trattamento con β-naftoflavone ha determinato una notevole diminuzione di questa attività nei campioni di fegato, mentre non ha avuto alcun effetto significativo sull'attività dei microsomi di rene. Questi dati, peraltro confermati anche a livello proteico dall'esperimento di Western blotting, sono in accordo con quanto riportato in letteratura per l'uomo, in cui, in colture di epatociti primari, il β-naftoflavone tende a diminuire l'attività del CYP2A6.
In conclusione, il quadro delle attività enzimatiche e dei saggi di inibizione presentato in questo lavoro di tesi hanno messo in evidenza chiare differenze fra i CYP2C di suino e quelli umani, suggerendo che, probabilmente, il suino non è il modello animale più adatto allo studio di farmaci che possono essere metabolizzati da questa importante sottofamiglia di P450.