• intramuscular electrode
• microfabrication

In questo lavoro di tesi è stata sviluppata e validata, mediante esperimenti in vitro e in vivo, un’interfaccia intramuscolare a film sottile che permette la registrazione e la stimolazione del muscolo. Tale interfaccia è stata sviluppata in maniera tale da garantire una buona selettività, un sistema di ancoraggio al muscolo e una buona conformabilità. L’elettrodo è una struttura bilaterale che presenta i siti attivi in entrambi i lati, identificati con le lettere U (Up) e D (down). Ogni lato presenta un sito di massa, uno di riferimento e 14 siti attivi (siti di registrazione e siti di stimolazione). Il numero di siti di registrazione e stimolazione varia a seconda della tipologia dell’elettrodo: l’elettrodo simmetrico ha 5 siti di registrazione e 9 siti di stimolazione; l’elettrodo asimmetrico, invece, ha 8 siti di registrazione e 6 siti di stimolazione. Tale interfaccia è stata realizzata per il muscolo tibiale del ratto per cui il diametro dei siti di registrazione corrisponde al diametro della fibra muscolare del tibiale del ratto in modo da garantire una buona selettività, mentre i siti di stimolazione hanno un’area maggiore rispetto ai precedenti in quanto è necessario avere una elevata capacità di carica iniettabile. Infine, possiamo distinguere elettrodi bidimensionali e tridimensionali. Nel primo caso i siti attivi sono sul piano principale dell’elettrodo, mentre nelle interfacce tridimensionali vi sono delle alette che, se opportunamente memorizzate, permettono di avere siti attivi in piani perpendicolari/sghembi rispetto al piano principale dell’elettrodo.
Gli elettrodi sono stati realizzati su un substrato flessibile di polimmide (PI2610, HD Microsystems) in cui sono state realizzate delle piste conduttive con un film sottile di titanio e uno di oro. La superficie dell’elettrodo è stata ricoperta da un film di polimmide in cui sono rimasti privi di isolamento solo le parti dell’elettrodo che devono connettersi con l’ambiente esterno. Per rendere gli elettrodi tridimensionali, è stato necessario effettuare la memorizzazione. Tale processo consiste nel posizionare l’elettrodo sopra un apposito stampo e inserire delle spine che attraversano l’elettrodo e entrano nei fori dello stampo in corrispondenza delle alette. Per completare la memorizzazione, l’elettrodo viene sottoposto a un trattamento termico. Infine, è stata fissata la parte extramuscolare dell’elettrodo alla PCB, utilizzando la colla d’argento per connettere elettricamente le due parti. All’altra estremità sono stati saldati dei fili conduttivi che hanno permesso di selezionare i diversi siti attivi durante le prove di caratterizzazione in vitro e in vivo. L’elettrodo è stato caratterizzato mediante prove elettriche e prove elettrochimiche.
Le prime consistono nel misurare la resistenza ohmica delle piste conduttive. I risultati sono stati divisi per tipologia di sito attivo in maniera tale da approssimare meglio la diversa lunghezza delle tracce: la resistenza ohmica media delle piste che collegano i pad ai siti di massa è 74,23 ± 30,11 Ω; quella relativa alle piste che collegano i pad ai siti di riferimento è 116,12 ±45,49 Ω; infine, quella relativa alle tracce che collegano i pad ai siti attivi è 228,59 ± 79,56 Ω. Le resistenze ohmiche ottenute sperimentalmente concordano con quelle teoriche. La variazione percentuale tra resistenza sperimentale e resistenza teorica oscilla tra il 6% e l’80%. La variazione percentuale più alta è quella relativa ai siti di massa e questo potrebbe essere riconducibile alle dimensioni del sito di massa molto più elevate rispetto agli altri siti attivi. Le prove elettrochimiche si distinguono in prove di voltammetria ciclica e prove di impedenza. Le prove di voltammetria ciclica ci permettono di conoscere la carica iniettabile nel sito attivo durante la stimolazione del muscolo. I risultati sono stati divisi per tipologia di sito (sito di massa, siti di stimolazione e siti di registrazione) e per utilizzo (elettrodi analizzati prima dell’impianto su modello animale, elettrodi analizzati dopo l’impianto su modello animale). La carica degli elettrodi pre-impianto per i siti di massa è 149,32 ± 19,95 nC, quella per i siti di stimolazione è 142,36 ± 63,7 nC e quella per i siti di registrazione è 163,97 ± 24,65 nC. La carica degli elettrodi post-impianto per i siti di massa è 69,04 ± 9,79 nC, quella per i siti di stimolazione è 68,92 ± 49,51 nC e quella per i siti di registrazione è 52,82 ± 36,36 nC. Il confronto tra elettrodi pre-impianto e post-impianto mostra una variazione percentuale di carica iniettabile di circa il 50 %. La causa della differenza di carica potrebbe essere collegata ad una delaminazione dell’oro dovuta a uno stress meccanico eccessivo durante l’impianto su animale oppure ad un danneggiamento del metallo a causa dell’alta frequenza di stimolazione. L’impedenza dell’elettrodo è stata analizzata mediante la spettrometria di impedenza elettrochimica (EIS). I risultati sono stati divisi per tipologia di sito (massa, riferimento, stimolazione e registrazione) e per utilizzo (elettrodi pre-impianto e post-impianto). L’impedenza degli elettrodi pre-impianto per i siti di massa è 112,25 ± 93,25 KΩ, quella dei siti di riferimento è 267,4 ± 57,34 KΩ, quella dei siti di stimolazione è 92,99 ± 72,52 KΩ e quella relativa ai siti di registrazione è 196,05 ± 49 KΩ. L’impedenza degli elettrodi post-impianto per i siti di massa è 7,24 ± 2,19 KΩ, quella dei siti di riferimento è 182,25 ± 31,47 KΩ, quella dei siti di stimolazione è 102,75 ± 52,54 KΩ e quella relativa ai siti di registrazione è 273,53± 120,14 KΩ. La variazione percentuale delle impedenze di elettrodi pre e post-impianto è elevata, soprattutto per i siti di massa. Questo è dovuto alla bassa impedenza post-impianto, probabilmente causata da qualche perdita di corrente o qualche cortocircuito. Le impedenze ricavate sperimentalmente sono dello stesso ordine di grandezza di quelle di altri elettrodi intramuscolari a film sottile presenti in letteratura [1][2][3]. Infine, queste interfacce intramuscolari sono state impiantate nel muscolo tibiale di alcuni ratti per verificarne l’effettiva funzionalità. Durante l’inserimento dell’elettrodo nel muscolo è stato notato che la differenza di larghezza tra il filamento passivo di polimmide e la sezione intramuscolare è troppo elevata. Questa differenza non permette un inserimento agevole e, in tale punto, l’interfaccia potrebbe rompersi. Inoltre, la PCB risulta troppo grande per possibili esperimenti in cronico, in quanto le dimensioni attuali non permettono il fissaggio della PCB alla zampa o alla schiena dell’animale. Sono state effettuate tre tipologie di prove in vivo: registrazione CMAPs (potenziale d’azione muscolare composto) mediante stimolazione neurale con elettrodo ad ago o con elettrodo intraneurale, registrazione segnale elettromiografico (EMG) mediante stimolazione nocicettiva e stimolazione di fibre muscolari e misurazione della forza di contrazione. Tali test sono stati effettuati seguendo i protocolli approvati dal Comitato Etico dell’Universitat Autònoma de Barcelona in conformità con la direttiva 2010/63/EU del Parlamento e del Consiglio Europeo. Nella prova di registrazione dei CMAPs sono stati impiantati 3 elettrodi in 3 ratti differenti e sono stati analizzati due parametri: la soglia minima di corrente per cui si ha l’insorgere del CMAP e la massima ampiezza alla massima corrente (15 mA).
Nella registrazione dei CMAPs mediante stimolazione ad ago si è notato che la soglia minima di corrente e l’ampiezza massima alla massima corrente variano in base al sito di registrazione analizzato. Questi risultati indicano che l’elettrodo è selettivo spazialmente. Inoltre, i segnali relativi a siti vicini tra loro sono risultati ridondanti. Questo potrebbe essere utile nel caso in cui alcuni siti siano non funzionanti. Il valore medio della soglia di corrente minima è 5,7 ± 1,7 mA, mentre il valore medio dell’ampiezza alla massima corrente è 1,33 ± 0,4 V. Anche nelle prove di registrazione mediante stimolazione con elettrodo intraneurale si nota che la soglia di corrente in cui si ha l’insorgere del CMAP e la massima ampiezza alla massima corrente (15 mA) variano in base al sito di registrazione analizzato. Quindi, anche in tale prova, viene dimostrata una buona selettività spaziale. Il valore medio della soglia di corrente minima è 6,43 ± 1,2 mA, mentre il valore medio dell’ampiezza alla massima corrente è 1,43 ± 0,32 V. Queste prove hanno dimostrato che è possibile stimolare sia con un elettrodo ad ago sia con l’elettrodo intraneurale. Entrambi i segnali registrati sono adeguati allo scopo ma, la stimolazione mediante elettrodo ad ago permette di avere soglia di corrente minima e ampiezza massima più elevate. La stimolazione del segnale EMG mediante stimolazione nocicettiva ha permesso di registrare il segnale EMG derivante dalla contrazione della zampa del ratto causata dalla sensazione di dolore. Tale stimolazione prevede quattro prove: pressure, pinch, controlateral pinch e strong pinch. In tutti e quattro i tipi di prova, si nota che il segnale registrato dall’elettrodo ad ago ha un’ampiezza maggiore rispetto a quella dei segnali registrati mediante elettrodo intramuscolare. Nell’ultima tipologia di prova, sono state stimolate le fibre mediante l’interfaccia intramuscolare presentata in questo lavoro di tesi ed è stata analizzata la forza muscolare. Inizialmente sono stati analizzati i siti di stimolazione con 1 impulso al secondo, variando la corrente da 2 a 6 µA (a passi di 1 µA) per poi impostarla a 10 µA. La massima ampiezza e la minima ampiezza alla massima corrente (15 mA) sono, rispettivamente, 403,4 mV e 28,5 mV. In alcune prove, i segnali ottenuti sono molto simili tra loro e questo è dovuto alla piccola distanza tra i siti di stimolazione che porta ad avere dei segnali ridondanti. I siti di stimolazione che hanno mostrato le risposte migliori sono stati utilizzati per le prove a fatica. Tali esperimenti prevedono di stimolare il muscolo con un treno di impulsi variando sia la corrente che il numero di impulsi al secondo. In ogni prova si può notare il fenomeno della fatica muscolare, ossia un lento decremento della forza. In quei punti, il muscolo non riesce a esercitare la forza necessaria per continuare a svolgere una certa azione. Infine, è possibile notare una brusca variazione del segnale. In quei punti, la forza non riesce a seguire il treno di impulsi che viene applicato mediante la stimolazione.
La brusca variazione della forza è dovuta allo stimolo monofasico prodotto dallo stimolatore (GRASS), il modello utilizzato non prevedeva la stimolazione bifasica.
La stimolazione monofasica, essendo un segnale interamente positivo, non permette all’interfaccia di scaricarsi capacitivamente. Questo provoca un aumento continuo del potenziale e il sito attivo va incontro a reazioni chimiche irreversibili (ad esempio reazione di ossidoriduzione). Queste reazioni tendono a degradare il sito attivo e ne compromettono la funzionalità. Tale problematica può essere risolta con l’utilizzo di uno stimolatore che permette di inviare segnali bifasici o con l’aumento della capacità di carica iniettabile nel sito attivo. La carica iniettabile viene influenzata dall’area del sito e dal materiale utilizzato. A parità di materiale, la carica aumenta all’aumentare dell’area del sito attivo. Se, invece, non è possibile aumentare l’area del sito, l’oro può essere sostituito con un materiale con alta capacità di carica iniettabile come l’ossido di iridio e il platino [4].

Bibliografia

[1] K. Y. Dario Farina, «Multichannel thin-film electrode for intramuscular electromyographic recording» J Appl Physiol, 2008.

[2] L. G. G. S. Guvanasen, «A Stretchable Microneedle Electrode Array for Stimulating and Measuring Intramuscular Electromyographic Activity» IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng., 2016.

[3] K.-P. H. W. Poppendieck, «Multi-channel EMG Recording and Muscle Stimulation Electrodes for Diagnosis and Treatment of Tremor» IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng., 2014.

[4] S. F. Cogan, «Neural Stimulation and Recording Electrodes» Annu. Rev. Biomed. Eng., 2008.