• vettori FIV-derivati
• vettori lentivirali
• test di neutralizzazione
• anticorpi neutralizzanti
• HCV

Il virus dell’epatite C (HCV) è oggetto di intensi studi. L’infezione da HCV colpisce circa il 3% della popolazione mondiale e costituisce un grave danno socio-sanitario. Il virus replica prevalentemente negli epatociti causando un danno epatico cronico che può portare allo sviluppo di epatite cronica, cirrosi del fegato ed epatocarcinoma. L’infezione inoltre incrementa il numero di complicazioni nelle persone infette dal virus dell’immunodeficienza umana. HCV evoca una risposta immunitaria sia di tipo cellulo-mediato che umorale che non sembra però in grado di eradicare l’infezione ed impedire la progressione della malattia. Un ruolo protettivo di primaria importanza sembra essere svolto dagli anticorpi neutralizzanti, capaci di legare i recettori di HCV (le glicoproteine E1 E2 dell’envelope di HCV) e di bloccarne quindi l’ingresso nelle cellule target. Il reale contributo di questi anticorpi è tuttavia ancora incerto data l’impossibilità di coltivare HCV in vitro e di sviluppare quindi dei test di neutralizzazione efficaci.
La mia tesi si è quindi incentrata sull’allestimento di un test di neutralizzazione con il quale misurare anticorpi ad attività neutralizzante in sieri di pazienti infetti da HCV. A tal fine, ho generato particelle virali pseudotipizzate con le glicoproteine E1 E2 dell’envelope di HCV mediante un sistema di vettori lentivirali derivati dal virus dell’immunodeficienza felina (FIV) prodotti e ideati nei nostri laboratori. Come controllo positivo abbiamo inoltre utilizzato un sistema di pseudotipi HCV ideato dal gruppo di ricerca del Dr. Cosset che utilizza vettori derivati dal virus della leucemia murina (MLV). Entrambi i vettori virali si basano su un sistema che utilizza 3 plasmidi (sistema split component): un costrutto di packaging esprimente i geni gag e pol necessari per l’espressione delle proteine strutturali ed enzimatiche del virus, sotto un promotore derivante dal citomegalovirus (CMV) che garantisce l’espressione in cellule eterologhe; un costrutto vettore contenente il segnale di incapsidamento e che presenta una cassetta di espressione per la green fluorescent protein (GFP); un costrutto envelope codificante per le glicoproteine di superficie E1 E2 di HCV. Alternativamente il costrutto envelope può contenere il gene codificante la proteina G del virus della stomatite vescicolare che viene utilizzato come controllo visto che riconosce come recettore di membrana una fosfatidilserina e quindi presenta un elevato tropismo d’ospite. I tre costrutti sono stati co-trasfettati in cellule 293T, una linea di fibroblasti renali embrionali umani, per formare virus pseudotipizzati che sono stati utilizzati per l’infezione della linea cellulare Huh-7 derivata da epatocarcinoma umano. Il test di neutralizzazione si è dimostrato rapido e sensibile ed in grado di rilevare la presenza di anticorpi in alcuni soggetti con epatite C cronica. Per un’ulteriore ottimizzazione è stato in seguito clonato il gene esprimente la luciferasi nel costrutto vettore FIV-derivato al posto della GFP. L’utilizzo di questo insieme al costrutto packaging ed envelope permette di sviluppare pseudovirus esprimenti la luciferasi. Questa ottimizzazione renderebbe il saggio maggiormente sensibile e ancora più rapido.