• progesterone
• preadipociti
• p-PI3K
• p-IRS1
• p-GLUT4
• estradiolo
• p-AKT
• differenziazione
• adipociti
• testosterone

Introduzione
È ormai noto da tempo che il tessuto adiposo contribuisce alla fisiopatologia dell’insulino-resistenza, dell’aterosclerosi, del diabete mellito e della sindrome metabolica; se, dapprima esso veniva considerato, semplicisticamente, il luogo di deposito di lipidi, immagazzinati all’interno di vescicole nelle cellule adipose, ora, il suo ruolo di organo endocrino è universalmente riconosciuto, grazie alla secrezione di molecole di matrice lipidica o proteica, aventi funzioni autocrine, paracrine ed endocrine. La quantità e la distribuzione del tessuto adiposo, durante la vita della donna, subiscono considerevoli mutamenti; durante la pubertà, la transizione menopausale e la gravidanza, laddove i livelli ormonali subiscono delle variazioni, si instaurano delle modificazioni nella sua localizzazione e quantità. Con la menopausa, si assiste, inoltre, ad un aumento della quantità di tessuto adiposo viscerale, che promuove il rilascio in circolo di acidi grassi, di fattori pro-infiammatori e pro-trombotici ed ad una sua prevalente ri-distribuzione a livello addominale.
Studi che si sono susseguiti negli anni hanno altresì dimostrato il fondamentale ruolo ricoperto dagli ormoni sessuali, nella regolazione e nella localizzazione dell’accumulo del tessuto adiposo, evidenziandone effetti diversi e conflittuali su colture primarie di preadipociti. Uno studio effettuato nel 2010 dimostrò il ruolo inibitorio del 17β-estradiolo (E2) nell’apoptosi degli adipociti umani, grazie ad un cross-talk che ha luogo tra insulin growth factor 1 (IGF1) e i pathway di segnale del recettore estrogenico (ER) nei preadipociti. In letteratura, sono state descritte le diverse azioni mediate dai recettori estrogenici α e β, localizzati nel tessuto adiposo, nel contesto del metabolismo lipidico, glucidico, della regolazione della massa totale di grasso e della sua localizzazione. L’estradiolo, inoltre, modula il segnale insulino-mediato grazie al suo recettore α e favorisce l’uptake di glucosio. Questo avviene grazie ai suoi trasportatori di membrana (GLUT), da parte degli adipociti attraverso la regolazione della fosforilazione della tirosina del recettore del substrato dell’insulina (IRS1), proteina chiave nella trasmissione del segnale insulino-mediato, consentendo, successivamente il reclutamento di molecole di segnalazione intracellulare come phosphoinositide 3 kinase (PI3K) e serine/threonine kinase (AKT).
Dagli studi emerge, al contrario, un ruolo controverso degli androgeni. Nella donna in stato di iperandrogenismo, i livelli di androgeni sono direttamente proporzionali alla massa totale di tessuto adiposo, ipotizzando un loro ruolo nella lipogenesi; anch’essi si sono dimostrati coinvolti nella differenziazione adiposa.

Presupposti teorici e obiettivi
Nonostante la correlazione clinica evidente tra le modificazioni della costituzione corporea della donna e la transizione menopausale, molto rimane ancora da chiarire circa i meccanismi molecolari sottostanti. Questo elaborato si pone come obiettivo lo studio dell’influenza dell’estradiolo sulla differenziazione dei pre-adipociti umani, con particolare attenzione posta all’interazione tra l’ormone e il pathway insulinico, inclusa la fosforilazione di IRS1, di GLUT4 e delle proteine di segnale PI3K e AKT.

Materiali e metodi
Lo studio è stato condotto utilizzando campioni di cellule SGBS, preadipociti derivati da pazienti con la sindrome di Simpson-Golabi-Behmel, che, contemporaneamente alla differenziazione, sono state trattate con estradiolo e l’inibitore del recettore degli estrogeni (ICI), al fine di valutarne la differenziazione in diversi intervalli di tempo. Le cellule sono state successivamente fissate in paraformaldeide al 4% e colorate con Oil Red O al fine di visualizzare i droplets lipidici, in seguito analizzati nel numero e nel diametro, grazie all’impiego del software ImageJ. Gli adipociti, dapprima differenziati, sono stati, inoltre, divisi in due gruppi: quelli trattati in presenza di alta (25 mM) concentrazione di glucosio quelli trattati con bassa (2.5 mM) concentrazione glucidica. Entrambe le classi sono state successivamente sottoposte a diversi trattamenti: estradiolo, insulina ed E2+insulina. Tramite l’utilizzo del Western-blot, sono stati studiati i profili di espressione delle proteine fosforilate IRS1, GLUT4, AKT e PI3K.

Risultati
Dallo studio è emerso che, rispetto al controllo, l’estradiolo è in grado di aumentare significativamente il numero e le dimensioni dei droplets lipidici contenuti negli adipociti maturi; questi aumenti si verificano in misura maggiore nei giorni intermedi della differenziazione, in particolare all’ottavo e al dodicesimo, dove l’azione ormonale appare più prorompente rispetto ai gruppi di controllo, piuttosto che nella fase finale della differenziazione.
Al contrario, l’effetto ormone-mediato risulta bloccato in presenza del suo rispettivo inibitore. È stato possibile quantificare il numero dei droplets effettivamente contenuti, nei diversi trattamenti tramite l’utilizzo del software ImageJ.
Grazie ai risultati delle indagini dell’espressione delle proteine effettuate, via Western-blot, è emerso che l’espressione delle forme fosforilate delle proteine IRS1 (p-IRS1), GLUT-4 (p-GLUT4), AKT (p-AKT) e PI3K (p-PI3K) può risentire della concentrazione glucidica. L’espressione delle fosfo-proteine subisce un aumento in presenza di una ridotta concentrazione di glucosio.
Indipendentemente dalla concentrazione glucidica, l’aumento più significativo si presenta nel caso del trattamento insulinico, che determina un picco nell’espressione di p-IRS1. Il trattamento di insulina ed estradiolo genera una diminuzione rilevante dell’espressione della proteina, rispetto alla sola insulina; in confronto al trattamento con solo estradiolo, tuttavia, l’espressione di p-IRS1 aumenta significativamente. Rispetto al trattamento con l’estradiolo, in presenza di un’alta concentrazione glucidica non si osserva un aumento significativo della espressione della fosfo-proteina; nel caso di un ambiente a bassa concentrazione di glucosio, si osserva, invece, l’aumento significativo della sua espressione.
Nell’espressione di p-GLUT4, gioca un ruolo fondamentale l’insulina, che ne provoca un aumento sia in condizioni di bassa sia di alta concentrazione glucidica. Il trattamento di E2+insulina determina una diminuzione notevole dell’espressione della proteina, rispetto all’effetto dei due fattori considerati singolarmente. Il trattamento con E2 ne provoca l’aumento significativo, solamente in condizioni di bassa concentrazione di glucosio.
L’espressione di p-PI3K e p-AKT aumenta solamente in presenza di bassa concentrazione glucidica; il trattamento con insulina ne provoca un significativo aumento e il trattamento di E2+insulina comporta un aumento meno marcato, rispetto al precedente, ma significativo rispetto al gruppo di controllo.

Conclusioni
Studi che si sono susseguiti negli anni hanno dimostrato il fondamentale ruolo ricoperto dagli ormoni sessuali nella regolazione e nella localizzazione dell’accumulo del tessuto adiposo, evidenziandone effetti diversi e conflittuali su colture primarie di preadipociti. L’importanza del tessuto adiposo e, da qui, la necessità di valutare le sue interazioni con gli ormoni sessuali, deriva dal suo contributo alla fisiopatologia dell’insulino-resistenza, dell’aterosclerosi, del diabete mellito e della sindrome metabolica.
Nel contesto della vita riproduttiva di una donna, le varie fasi sono scandite da variazioni dei livelli ormonali e, contemporaneamente, si verificano delle modificazioni della costituzione corporea e dei profili di sensibilità o resistenza all’insulina.
Nello studio presentato, è stato quindi possibile indagare il ruolo dell’estradiolo nella differenziazione adipocitaria e comprendere alcuni aspetti fisiologici. Ciò è stato reso possibile grazie all’impiego di pre-adipociti derivati da pazienti affetti dalla sindrome di Simpson-Golabi-Behmel (SGBS), unici ed utili allo studio della biologia delle cellule adipose umane.
Dai risultati ottenuti, è stato osservato che l’estradiolo funge da stimolo nella differenziazione adiposa, determinando un aumento del numero e delle dimensioni delle vescicole lipidiche contenute all’interno delle cellule trattate.
Lo studio dell’interazione tra gli ormoni e le proteine appartenenti al pathway di segnale insulinico rivela come l’espressione delle loro forme attive fosforilate aumenti o diminuisca a seconda dell’ambiente glucidico e dei trattamenti con E2 ed insulina.
Questi diversi pattern, valutati per ciascuna proteina presa in esame, potrebbero indicare un ruolo fondamentale, ricoperto da E2, nel metabolismo glucidico; in presenza di bassa concentrazione di glucosio, esso determina un aumento dell’espressione delle proteine fosforilate del pathway insulinico, ricoprendo il ruolo di attivatore della via. Indipendentemente dalla variabile glucidica per p-IRS1 e p-GLUT4 e in presenza di bassa concentrazione di glucosio per p-AKT e p-PI3K, il trattamento di E2 e insulina determina un aumento significativo dell’espressione delle fosfo-proteine rispetto all’effetto del solo estradiolo, ma minore rispetto all’insulina.
Dallo studio effettuato si può evincere che il 17β-estradiolo e l’insulina interagiscono, embricandosi nella stessa via di segnale nelle cellule adipose. Questo può contribuire ad una ulteriore comprensione della biologia dei cambiamenti fisiologici e le modificazioni della struttura corporea che i verificano durante la pubertà, la transizione menopausale e la gravidanza, laddove i livelli ormonali subiscono delle variazioni, ma, soprattutto, è ipotizzabile che queste nuove acquisizioni possano costituire un passo avanti nella conoscenza di patologie che comportano alterazioni ormonali, come la sindrome dell’ovaio policistico, caratterizzata da disordini endocrino-metabolici che si manifestano con insulino-resistenza e iperandrogenismo.
Anche la ciclicità mestruale, laddove essa stessa è contraddistinta da variazioni nelle concentrazioni ormonali, può determinare, a seconda del giorno considerato, un impatto diverso sulla sensibilità all’insulina; ciò, in ambito terapeutico, si traduce in un possibile impatto su entrambi i sistemi, sessuale ed insulinico, da parte di terapie farmacologiche ormonali ed insulino-sensibilizzanti.
In conclusione, i risultati dello studio svolto permettono di evidenziare l’interazione tra l’estradiolo e l’insulina in una via metabolica comune. Ciò consente di avanzare delle ipotesi, da verificare in futuro, circa l’implicazione ormonale nella differenziazione dei preadipociti sia nelle diverse fasi della vita della donna sia nel contesto di patologie che modificano il contesto biologico, ormonale e metabolico. È quindi necessario documentare l’interazione del segnale, tra le vie di trasmissione sessuali e metaboliche, che potrebbe fornire delucidazioni su tali fenomeni fisiologici e patologici.