• Genome editing
• galectina-3
• CRISPR/Cas9
• knock-in

Il sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas) è un meccanismo di difesa immuno-adattativo utilizzato da Archea e Bacteria per la degradazione di materiale genetico estraneo.
Sono stati individuati tre diversi sottotipi di sistemi (Tipo I, II e III) che differiscono per il numero e per la tipologia di endonucleasi coinvolte. L’interesse della comunità scientifica si è rivolto in particolar modo verso il sistema CRISPR/Cas9 di tipo II, individuato per la prima volta in Streptococcus pyogenes, che risulta essere il migliore e il più utilizzato metodo per effettuare manipolazioni geniche, come ad esempio knock-in, knock-out e knock-down. Infatti, negli ultimi anni, grazie alla sua semplicità e versatilità, rispetto ad altre tecnologie in grado di indurre modificazioni genetiche (TALEN, ZFN), questa metodica è stata impiegata in diversi ambiti, quali terapia genica, ricerca di nuovi farmaci e biologia sintetica.
Il CRISPR/Cas9 di tipo II è costituito da una ribonucleoproteina, data dall’endonucleasi Cas9 a cui fa seguito un RNA guida di circa 20-nt (sgRNA), che dirige l’endonucleasi stessa. La ribonucleoproteina è in grado di identificare la sequenza trinucleotidica (NGG) PAM (Protospacer Adjacent Motifs), presente in più copie a livello del genoma, preceduta da una sequenza complementare al sgRNA, inducendo la formazione di un taglio al doppio filamento di DNA (DSB). La cellula risponde a quest’ultimo con due diversi meccanismi di riparazione: la ricombinazione non omologa (NHEJ), meccanismo error prone che induce mutazioni di tipo inserzione/delezione (indel), e la ricombinazione omologa (HDR), che ripara il danno DSB utilizzando un filamento di DNA stampo, senza inserire mutazioni.
Il presente elaborato si inserisce in un ampio progetto di ricerca, il cui scopo è quello di delineare il ruolo funzionale del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) rs4644 nel gene LGALS3, per il quale è stata dimostrata un’associazione con il rischio di sviluppare diversi tipi di cancro.
A tal proposito, linee cellulari umane isogeniche che differiscono dalla linea parentale per il solo SNP di interesse saranno create mediante il sistema CRISPR/Cas9. Nello specifico sono stati utilizzati tre approcci differenti. Nel primo caso abbiamo impiegati due vettori, PX458 e PX459, dissimili esclusivamente per il marker di selezione, contenenti il gene codificante per la Cas9, la quale va ad indurre un taglio a livello del genoma inducendo un DSB nel DNA. Nel secondo caso è stata utilizzata una strategia diversa, nota come CRISPR double nickase, che va ad aumentare la specificità, diminuendo il numero di off-target e mantenendo un alto livello di efficienza. In quest’ultimo caso due plasmidi, ciascuno codificante per una Cas9 mutante, sono diretti verso una specifica regione del DNA genomico, dall'RNA guida target specifico. Ciascun complesso Cas9/sgRNA crea un taglio al singolo filamento (SSB) e il doppio nick, creato dai due complessi, mima un DSB. La terza tecnica prevede l’impego di vettori lentivirali come mezzo di trasfezione di un plasmide contenente la Cas9 inducibile da doxyciclina e resistente alla puromicina e di un vettore con sgRNA target e resistenza alla blasticidina. La riparazione del DSB viene mediata da due elementi: un single-stranded donor oligonucleotides (ssODN), avente regioni fiancheggianti omologhe alla regione target e l’allele di interesse posto al centro della sequenza, o un donor vector avente braccia di omologia fiancheggianti il sito interessato dal danno.
Lo scopo della presente tesi è quello di individuare non solo il miglior sistema per effettuare il knock-in genico, inteso come l’impiego del CRISPR-cas9 in associazione con il ssODN o in associazione con il donor vector, ma anche la migliore sgRNA. Per quest’ultimo aspetto, ci si è avvalsi dell’utilizzo di un tool bioinormatico, quale CHOPCHOP. Nello specifico, sulla base degli off-target e della qualità sgRNA, sono state selezionate due guide, che riconoscono lo SNP di nostro interesse.
I dati preliminari mostrano, complessivamente, una buona specificità ed efficienza da parte delle sgRNAs utilizzate e dei tre approcci adoperati. Ulteriori saggi dovranno essere condotti allo scopo di determinare il miglior metodo e la miglior guida che ci permettano di ottenere le linee cellulari modificate. Analisi in silico come TIDER assay, ma anche genotipizzazione delle linee modificate dovranno essere effettuate per verificare l’effettivo gene-editing.