• biossido di titanio
• Comet assay
• nanoparticelle
• tursiops truncatus

RIASSUNTO

Il crescente sviluppo delle tecnologie legate a produzione e impiego di nanoparticelle (materiali con almeno una dimensione compresa tra 1 e 100 nm) ha causato il proliferare di studi riguardanti le proprietà fisicochimiche, le possibili interazioni con i sistemi biologici e il conseguente impatto sull’ambiente e gli organismi viventi di questi materiali. Tuttavia, la maggior parte delle ricerche è focalizzata sui potenziali rischi per la salute umana, mentre ancora poche informazioni si hanno sull’impatto di questi materiali su specie a rischio, quali ad esempio i mammiferi marini.
Scopo di questo studio è stato valutare il potenziale effetto genotossico di particelle di biossido di titanio, TiO2 su leucociti isolati di delfini della specie Tursiops truncatus (Montagu, 1821).
L’imput di particelle di biossido di titanio in ambiente marino ha origine sia industriale che non, derivando sia direttamente che indirettamente da produzione e utilizzo di cosmetici e creme solari, dilavamento da discariche e liquami applicati ai suoli, deposizioni atmosferiche successive all’incenerimento dei rifiuti. Considerata la grande scala di produzione e utilizzo di questi materiali, è inevitabile che le nanoparticelle e i loro derivati si accumulino in ambiente acquatico, e possano esplicare il loro potenziale effetto genotossico sugli organismi viventi sia a breve che a lungo termine. In particolare, vanno monitorati e salvaguardati organismi a rischio come i mammiferi marini che, essendo predatori terminali al vertice delle reti trofiche, tendono ad accumulare alte concentrazioni di contaminanti e sono dunque soggetti ad elevato rischio tossicologico.
Per questi motivi i test condotti sono stati effettuati attraverso un approccio non invasivo, utilizzando leucociti isolati da sangue prelevato da cinque tursiopi in cattività presso il delfinario Oltremare srl di Riccione.
Sono state testate due forme di TiO2, caratterizzate da diversi reticoli cristallini: rutilo, di dimensioni < 5000 nm, e anatasio, di dimensioni < 25 nm. Per l’esposizione in vitro, le nanoparticelle sono state sospese in RPMI e sonicate per 30 minuti ad una frequenza di 35 kHz; i leucociti sono stati isolati attraverso un processo di lisi. L’esperimento ha previsto l’esposizione dei campioni di sangue di ogni animale in tre tempi (4, 24 e 48 ore) a tre dosi (20, 50 e 100 microg/ml) delle due forme di TiO2; un controllo per ogni tempo; due repliche per ogni combinazione di dose e tempo.
La valutazione dell’effetto genotossico è stata effettuata attraverso l’ Alkaline Single Gel Electrophoresis, o Comet Assay, mentre una valutazione dell’effetto citotossico è stata fatta utilizzando la colorazione con Trypan Blue.
I risultati mostrano un’elevata vitalità cellulare, compresa tra l'85% e il 100% anche dopo esposizione alle dosi più alte di TiO2, per tutti i tempi di esposizione. Un aumento significativo della migrazione di DNA (proporzionale al danno genetico) rispetto ai controlli è stato rilevato dopo 24 e 48 ore di esposizione alle dosi più elevate di rutilo e dopo 48 ore di esposizione a anatasio.
I risultati ottenuti indicano, per le dosi e i tempi testati, un effetto geno- e cito- tossico lieve delle particelle di TiO2 sui leucociti isolati, con genotossicità leggermente maggiore per il rutilo.
Da un confronto con gli studi preesistenti, i leucociti di tursiope risultano essere meno suscettibili all’esposizione a particelle di TiO2 rispetto a quelli umani, e più sensibili rispetto a quelli di pesci, organismi marini che non mostrano subire alcun effetto genotossico dopo esposizione a TiO2. Tuttavia, queste differenze potrebbero essere anche legate alle diverse dimensioni delle particelle utilizzate e ai diversi tipi di interazione con il mezzo in cui esse sono state disperse. Si rendono dunque necessarie ulteriori indagini per comprendere l’influenza dei fattori fisicochimici e delle interazioni tra nanoparticelle e biomolecole nel determinare gli effetti di questi materiali sugli esseri viventi.

ABSTRACT

Assessing genotoxicity of TiO2 particles in isolated bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) leukocytes

The growing development of technologies based on the production and use of nanoparticles (materials with at least one dimension sized between 1 and 100 nm) is driving an increasing research interest for the interactions of nano-materials with living systems and their potential health hazard. Nevertheless, most of the results that have been published in recent years concern the risks associated with human exposure, while very few information has been produced about the environmental impact of nanomaterials and none of these regard endangered species, like marine mammals.
The aim of this study is to evaluate the genotoxic potential of titanium dioxide (TiO2 ) particles on isolated leukocytes of the bottlenose dolphin Tursiops truncatus (Montagu, 1821).
The input of nanoparticles in the aquatic environment is likely to be due both to industrial and non-industrial sources, deriving from the production and use of cosmetics and sun creams, sewer sources, leaching from landfill or soil applied sewage sludge and atmospheric sources from waste combustion. Given that nanotechnology industries plan large scale production, it is inevitable that these products and their by-products will reach and accumulate in the aquatic environments.
Endangered species, like marine mammals, that are subject to contaminants bioaccumulation and prone to pollution impacts, are to be monitored and protected preferentially.
For those reasons, our tests were made using a non-invasive approach, based on the use of cells isolated from blood taken from five specimens of bottlenose dolphin reared in captivity by Oltremare srl in Riccione in order to achieve a preliminary assessment of the susceptibility of a toothed cetacean to particulate TiO2 exposure.
Two different forms of TiO2 were tested: rutile, sized < 5000 nm, and anatase, sized < 25 nm. For in vitro exposure, nanoparticles were suspended in RPMI and sonicated at 35 kHz for 30’; leukocytes were isolated with the lysis procedure. Blood samples were exposed for 4, 24 and 48 hours to three different concentrations (20, 50 e 100 g/ml) of rutile and anatase, including a control.
Genotoxic effects were evaluated by the Alkaline Single Gel Electrophoresis or Comet Assay (detecting single and double DNA strand breaks, as well as alkali labile sites), and cells viability was evaluated by the Trypan Blue exclusion assay. Electron Microscopy was also used for assessing the aggregation of particles in experimental suspensions.
Results show a statistically significant increase of DNA fragmentation detected after 24 and 48 hours of exposure to the highest doses of rutile and after 48 hours of exposure to anatase. These data suggest a slight genotoxic effect of titanium dioxide particles on isolated dolphin leukocytes at the concentrations and times tested. Cell viability was always high, exceeding 85% after experimental exposures, suggesting the absence of a significant cytotoxic effect of TiO2.
Comparing our results with other studies, bottlenose dolphin leukocytes seem to be less susceptible to TiO2 than the human ones, but more than fish cells. However, the influence of particle size and/or interactions with the medium on experimental results cannot be excluded.
More studies are requested to investigate the influence of different physical-chemicals factors as well as of the interactions between nanoparticles and living systems in determining the effects of these materials on organisms.