• fluorescenza
• proteine
• fotocromismo
• spettroscopia Raman
• GFP

In questa tesi mi sono occupato della fotofisica di alcune proteine fluorescenti derivate dalla proteina verde fluorescente (GFP), indagando in particolare i processi di fotoconversione a cui esse possono andare incontro in seguito ad assorbimento di luce visibile o ultravioletta. Una molecola che si trovi in uno stato elettronico eccitato può infatti dissipare energia per diverse vie, quali il rilassamento termico, l'emissione di radiazione (fluorescenza o fosforescenza) e una serie di altri fenomeni spesso descritti come “fotocromici”, ovvero che comportano una variazione delle proprietà chimiche e fisiche della sostanza. Esempi di meccanismi alla base di queste variazioni sono le isomerizzazioni cis-trans o la perdita di un protone. Il lavoro si è concentrato su due mutanti (E222Q E$^1$GFP e BFPF) progettati ad hoc come versioni “modello” di proteine molto usate in biofisica e biologia. Grazie a questa scelta è stato possibile analizzare dettagliatamente i risultati e fornire modelli precisi per la fotochimica di queste proteine e delle classi di proteine ad esse simili.

Come tecnica sperimentale è stata adottata la spettroscopia Raman pre-risonante. Questo approccio ha permesso di selezionare i modi vibrazionali del cromoforo (ovvero della parte della molecola responsabile dell'assorbimento di luce visibile) e poter così monitorare le sue modificazioni strutturali in stretto collegamento con le previsioni derivate da simulazioni al calcolatore.

La tesi sarà aperta da una panoramica sulle proprietà chimico-fisiche ed ottiche delle proteine fluorescenti, con particolare attenzione ai mutanti più usati. Verrà poi introdotto il concetto di fotocromismo e mostrate le sue manifestazioni in tali molecole; sarà quindi proposto il modello a partire dal quale si è sviluppata la presente ricerca. Seguirà una trattazione della spettroscopia Raman sotto il profilo teorico e sperimentale, con un occhio di riguardo al suo utilizzo in ambito biologico ed in particolare alla sua utilità per il nostro progetto. Successivamente viene descritta l'attività svolta in laboratorio, dal trattamento dei campioni all'acquisizione dei dati.

Infine, i dati su proteina vengono confrontati con risultati già ottenuti su cromofori – di più facile interpretazione – e da questo confronto emergerà una spiegazione dei fenomeni fotofisici osservati: in tali proteine il comportamento fotocromico è effettivamente descritto bene da un'isomerizzazione cis-trans del cromoforo attorno al doppio legame centrale, eventualmente accompagnata da un cambiamento nello stato di protonazione.