• EHDV

Il virus della malattia emorragica epizootica del cervo (EHDV), comunemente denominata Epizootic Hemorragic Disease (EHD) appartiene al genere Orbivirus, famiglia Reoviridae ed è suddiviso in 7 sierotipi. EHDV è un virus del diametro di circa 80 nm, sprovvisto di envelope a struttura icosaedrica formata da due gusci proteici concentrici. Il genoma virale è costituito da 10 segmenti di RNA bicatenario codificanti per altrettante proteine virali, di cui 7 strutturali (VP1-VP7) e 3 non strutturali (NS1, NS2 e NS3). Le proteine che costituiscono il capside esterno (VP2 e VP5) servono per l'ingresso del virus nelle cellule bersaglio. VP2 stimola la produzione di anticorpi neutralizzanti sierotipo-specifici. Il guscio proteico interno è formato da VP3 e VP7; quest'ultima proteina in particolare determina la specificità del sierogruppo. EHDV è trasmesso da insetti vettori biologici appartenenti al genere Culicoides ed infetta in particolare il cervo a coda bianca, ma anche altri cervidi (cervo mulo, antilope, cervo a coda nera e cervo rosso). Recentemente sono stati descritti casi di infezione naturale anche nel bovino, mentre gli ovini sono ricettivi all’infezione sperimentale. EHDV non infetta l’uomo e pertanto interessa solo la patologia veterinaria. Il virus non si trasmette da un animale all’altro per contagio, ma solo mediante insetti vettori. I cambiamenti climatici in atto hanno esteso i periodi di attività dei vettori e il loro areale. Il trasporto dei vettori infetti mediante le correnti aeree svolge un ruolo importante nella trasmissione dell'infezione da una zona all’altra (anche a distanze superiori ai 100 Km). Recentemente il virus è stato isolato nei bovini in diverse regioni del Nord Africa e Medio Oriente. Pertanto è possibile che i vettori infetti possano raggiungere il sud Europa. Tale eventualità metterebbe a rischio i bovini europei vista la mancanza di un vaccino contro l’EHDV.
Lo scopo della tesi è quello di valutare l’espressione in vitro delle 4 proteine che vanno a costituire la struttura del virus (VP2, VP3, VP5, VP7) prodotte tramite baculovirus ricombinanti. Tali proteine se espresse nella loro conformazione nativa possono assemblarsi a formare Virus Like Particles (VLPs) ed essere utilizzate come antigeni sia per la diagnosi sierologica che per la immunizzazione degli animali. Nel nostro lavoro abbiamo utilizzato uno stipite virale originariamente identificato come un nuovo sierotipo di EHDV, (EHDV-9) che è stato isolato in Marocco nel 2006. Una caratterizzazione genetica più accurata di questo stipite ha successivamente dimostrato che si trattava di un nuovo virus originatosi a seguito di riassortimento genetico fra i sierotipi 2 e 6.
L’espressione delle proteine ricombinanti è stata effettuata tramite infezione di cellule di insetto con i relativi baculovirus generati in laboratorio. Le cellule di insetto utilizzate appartengono alle linee cellulari Sf 21 e Sf 9, ottenute da tessuto ovarico della farfalla Spodoptera frugiperda. Per la generazione dei baculovirus i segmenti genomici codificanti per le proteine virali sono stati inizialmente clonati nel vettore pAcUW51 che permette l’espressione contemporanea di due proteine usando promotori diversi orientati in senso opposto (Ph e p10).
Più precisamente, un baculovirus ricombinante esprimeva contemporaneamente le proteine VP7 e VP3 che costituiscono il capside interno (core), mentre l’altro le proteine VP5 e VP2 che costituiscono il capside esterno. Al fine di verificare l’espressione proteica ottimale, sono state condotte diverse infezioni usando MOI variabili da 2 a 5. Le cellule sono state infine raccolte a tempi diversi (24, 48, 68 ore post infezione). Dopo diversi esperimenti la MOI ottimale è risultata essere 3 ed il tempo ottimale di raccolta delle cellule è risultato di 60 ore.
Al fine di valutare l’espressione proteica le cellule sono state lisate sottoposte a SDS-PAGE e successivamente sono state eseguite colorazioni dei gels con il Blue di Commassie.
I risultati fino ad ora ottenuti fanno pensare ad una buona espressione delle proteine ricombinanti .
Attualmente stiamo effettuando esperimenti di Western blotting usando anticorpi specifici per una identificazione immunologica delle proteine prodotte.
Al fine di verificare che le proteine strutturali siano espresse correttamente e riescano ad assemblarsi nelle VLPs, stiamo procedendo alla ultracentrifugazione dei lisati cellulari in gradiente discontinuo di saccarosio osservando i campioni al microscopio elettronico in colorazione negativa.