• real time pcr
• ibridazione in situ
• ibrido
• serra
• ogm
• modifica genetica

In questo lavoro di tesi si è preso in esame l’ibrido Kalanchoe xhounghtonii, una crassulacea ottenuta dall’incrocio tra K. daigremontiana (pianta portaseme) e K. delagoensis (pianta donatrice di polline). Caratteristica saliente di questo ibrido è la marcata viviparia, ossia la capacità di produrre plantule intere su piccoli supporti presenti tra due denti del margine fogliare. Le plantule, cadendo a terra, radicano facilmente, generando piante complete. Per una pianta, possedere la caratteristica di potersi riprodurre asessuatamente offre vantaggi in termini ecologici ed evolutivi e, per specie coltivate, la rilevanza riguarda anche la sfera economica. Per questa ragione lo studio di piante che manifestano il carattere della viviparia riveste particolare importanza e in questo ambito la K. xhounghtonii può essere impiegata come pianta modello.
Nello specifico è stata studiata la funzione del gene KxhKN5 (Kalanchoe xhounghtonii knotted 1-like homeobox protein (KN5)), appartenente ai geni KNOX di classe I, per valutarne il coinvolgimento nel fenomeno in esame.
Gli esperimenti sono stati condotti su piante wild type (controllo) e transgeniche. In queste ultime la modifica riguarda l’inserimento di un costrutto rispettivamente per la sovraespressione e per il silenziamento del gene KxhKN5. Su questo materiale sono stati eseguiti studi allo scopo di valutare l’espressione del gene da un punto di vista spaziale e temporale, con metodi immunoistochimici e molecolari, e con prove in vivo.
Sono state condotte valutazioni fenotipiche in diversi momenti di sviluppo delle piante in vivo, volte all’identificazioni degli effetti del gene sulla morfologia. Sono stati presi in esami caratteri quali: altezza, numero di internodi, lunghezza media di un internodo, lunghezza e larghezza della foglia. I risultati ottenuti sono stati analizzati statisticamente con il supporto del programma COSTAT. Inoltre sono stati effettuati rilievi quantitativi circa la produzione di propaguli. Tra le piante che sovraesprimono KxhKN5 si sono delineati quattro principali fenotipi: normale, palmato, curly e curly accentuato.
Analisi di PCR quantitativa sull’RNA totale hanno poi permesso di ottenere una quantificazione dei prodotti del gene nei diversi stadi fenotipici (meristema con primordi fogliari, foglie di 0,5 cm, di 3 cm e di 5 cm) nelle piante wild type, silenziate e sovraespresse. Utilizzando la metodica della Real Time PCR si è appurato che l’espressione del gene, nelle piante non modificate, è maggiore nello stadio meristematico. Nelle piante silenziate, come atteso, l’espressione è inferiore rispetto al controllo, così come nelle sovraespresse la stessa è modulata positivamente. Sono state identificate quindi le piante maggiormente silenziate e sovraespresse.
Allo scopo di approfondire le conoscenze circa la localizzazione spaziale dei prodotti di KxhKN5, sono state compiute prove di ibridazione in situ su sezioni di piante, con sonde ottenute dal gene stesso. Nelle piante wild type e nel clone sovraespresso, i trascritti di KxhKN5 sono localizzati maggiormente nella zona periferica dell’apice meristematico, mentre nel doma l’espressione sembra essere meno intensa. Il clone silenziato mostra invece solo una blanda espressione di KxhKN5 nel doma e nella foglia.Osservazioni istologiche hanno mostrato variazioni nella forma stessa del doma.
Nell’incertezza che l’ibrido a disposizione fosse triploide o tetraploide, è stato condotto il conteggio del numero di cromosomi. Si è così constatata così la tetraploidia dell’ibrido, in cui sono stati contati 68 cromosomi (4x= 2n=68).
Infine è stata condotta la quantificazione del numero di copie del transgene KxhKN5 (analisi del copy number) presente nei vari cloni sovraespressi: sono risultate da 1 a 6 copie esogene.
In conclusione le analisi non hanno dimostrato un coinvolgimento considerevole di KxhKN5 nel fenomeno della viviparia, bensì nella determinazione dell’architettura della pianta e della morfologia fogliare, caratteri che possono influenzare indirettamente il manifestarsi di questa forma di riproduzione asessuata.